优势产品推荐| |二代测序核心原料5rApp探针的应用

近年来，小RNA的高通量二代测序取得了快速进展，这增加了对5’端腺苷酸化（rApp, pp代表5’到5’二磷酸连接）修饰的寡核苷酸接头的需求。5'-腺苷酸化寡核苷酸可以连接到不同序列的3'-OH端，常用于miRNA等3’端为羟基的RNA或3’端为羟基的单链DNA在克隆、高通量测序建库或PCR检测等时，在3’端添加的接头。

一、5`-rApp修饰接头的制备

TDM

DNA/RNA寡核苷酸5'端的腺苷酸化可以通过化学方法进行，也可以酶促方式进行。以腺苷酰化酶为例，用5’端磷酸化的单链DNA/RNA作为底物，腺苷酰化酶将ATP分解为AMP和PPi，AMP转移到单链DNA/RNA的5’磷酸基团上，形成腺苷酰化单链DNA/RNA，从而制备出腺苷酰化接头。为了防止5’端腺苷酰化(rApp)修饰的寡核苷酸接头自连接，需要在3'端添加封闭基团，例如2',3'-双脱氧核苷酸或3'-氨基接头。由此产生的5'-rApp寡核苷酸是稳定的，可用于任何基于连接的应用。

二、5`-rApp修饰接头的应用

TDM

  • 5'端标记

  • 活化的富含5'-嘧啶的RNA

  • 作为体外选择的核糖/脱氧核酶的活化核酸底物

  • 拓宽核糖/脱氧核酶可探索的RNA底物范围

  • 二代测序/miRNA文库构建

许多高通量小RNA的二代测序方案在cDNA文库制备过程中会使用5'预腺苷酸DNA寡核苷酸接头。将DNA寡核苷酸测序接头连接到未知RNA上，使RNA在逆转录后通过其cDNA进行测序。这种方法对于小RNA和其他非多聚腺苷酸化RNA特别有用。这种方法的一个关键技术进步是使用预先形成的5’腺苷酸化接头（AppDNA）为逆转录酶引物提供结合位点。

以这种方式修饰的接头代表了可分离的底物中间体，这些中间体可以在新的磷酸二酯键形成之前进入DNA和RNA连接酶的多步反应途径。使用预腺苷酸化接头可以将连接反应从ATP依赖中解放出来，从而避免了具有5’磷酸化末端的RNA的ATP依赖性环化和多聚化。由于许多天然存在的RNA（例如，pre-miRNA、成熟miRNA和各种RNA降解产物）带有5'磷酸基团，这一优势使得预腺苷酸化测序接头在小RNA测序应用中变得司空见惯。

同样，在miRNA文库构建中，体内加工的miRNA很短(21-23nt)，且具有5’-磷酸和3’-OH末端基团，因此，从细胞RNA构建高质量的miRNA文库比较困难，因为使用T4 RNA连接酶和ATP将接头连接到miRNA末端，会导致高水平的miRNA自连接。

使用5'-rApp修饰的接头可以避免这一问题的发生。在没有ATP的情况下，首先使用连接酶将5'-rApp修饰的接头连接到miRNA的3'-OH末端，然后在ATP存在的情况下将第二个接头连接到接头-5’-3’-miRNA的5'-磷酸基团末端。这样，miRNA文库中miRNA分子两端就都有合适的接头，可以克隆到合适的载体中，以便随后进行测序。

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参考文献：

[1]LodoeLama, Kevin Ryan. Adenylylation of small RNAsequencing adapters using the TS2126 RNA ligase I. RNA. 2016 Jan;22(1):155-61.

[2]YangmingWang, Scott K Silverman. Efficient RNA 5’-adenylationby T4 DNA ligase to facilitate practical applications. 2006 Jun;12(6):1142-6.

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