载体构建/质粒构建步骤有哪些？

载体构建过程：

1、引物设计

2、目的片段选取：RNA提取、RNA反转录、PCR扩增、PCR产物纯化

3、双酶切

4、连接:T4 DNA ligase连接或者同源重组连接（新贝生物：#B101、#B102）

5、转化

6、菌落PCR

7、测序：1)摇菌；2)送样; 3)比对 ；

8、菌种保存：菌种比对成功，则可保存菌种备用。

9、质粒提取：菌种比对成功，冻存菌种后，菌液用于提取质粒。

一、载体构建基本原理

分、切、连、转、筛

1、分：分离出要克隆的目的基因及载体。

2、切：用限制性内切酶切割目的基因和载体，使其产生便于连接的末端。

限制性内切酶：是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。

限制性核酸内切酶根据识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性分为三大类。

其中Ⅱ型酶能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内切割，产生特异性DNA片段，是DNA重组技术中常用的酶。

Ⅰ型酶：具有修饰和切割功能，无固定切割位点

Ⅲ型酶与Ⅰ型类似，能识别特异位点，但切割位点在识别位点以外

Ⅱ型酶特点：

①识别顺序一般为4－6个碱基对

②识别顺序具有180度的旋转对称性，呈完全的回文结构

③Ⅱ型酶对双链DNA两条链同时切割，可产生两种不同末端：平末端，粘末端

平末端：在识别顺序的对称轴上，对DNA同时切割形成平末端，如：SmaI

5’－CCC GGG－3’                           5’－CCC           GGG－3’

3’－GGG CCC－5’                           3’－GGG           CCC－5’

5′突出粘末端：在识别序列的两侧末端切割DNA双链，于对称轴的5 ′末端切割产生5 ′端突出的粘性末端，如：Hind Ⅲ

5’―AAGCTT―3’                          5’― A               5’－AGCTT―3’

3’―TTCGAA―5’                          3’― TTCGA－5’               A―5’

3′突出粘末端:与5′突出粘末端作用相反，产生3 ′端突出粘末端，如：PstI

5’―CTGCAG―3’                          5’―CTGCA－3’               G―3’

3’―GACGTC―5’                          3’―G               3’－ACGTC―5’

3、连：将切割后的目的基因和载体用T4 DNA连接酶连接或者同源重组方法连接。

①来源：T4 DNA连接酶是T4噬菌体基因30编码的产物。最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的。分子量为68KD，。

②最佳pH7.2-7.8，常用的反应液为pH7.6的Tris－Hcl

③需要ATP作为辅助因子并由ATP提供能量

④DTT等巯基化合物可促进连接酶的连接作用

⑤高浓度的钠、钾离子等抑制酶活性

4、转：把连接好的重组载体转化入感受态细胞的过程（细菌：E.coli，真菌：Yeast，昆虫细胞或哺乳动物细胞）。

5、筛：在不同层次上、不同水平上进行筛选，鉴定所需的特异性重组子。使用各种方法，将带有重组载体的宿主菌从培养基中筛选出来。例如：载体大小，酶切结果，筛选标记等。