仙桃学术 | 2021年6 纯生信老套路，焕发新春！亮点在这些美图上，今天教你复现！

大家好，我是浮浮~

之前有小伙伴反馈说基因家族太难，还是单基因好做一些。

但是单基因的生信文章不太容易发了。

那么今天我们零代码复现一篇今年发表在Frontiers in Oncology杂志上的单基因泛癌生信文章，该杂志最新影响因子已经涨到了6.2分！话不多说，动手复现起来吧。

看图表，梳理思路

Figure1 

主要展示了主变量ATG5在多种正常组织、肿瘤细胞中的表达情况以及癌与癌旁、癌与正常组织中的表达差异情况。

Figure2 

分析了ATG5对33种肿瘤总体生存的影响

Figure3 

绘制了总体生存时间的KM曲线

Figure4 

展示了ATG5在多种肿瘤中的免疫浸润分析（现在免疫浸润是生信分析的热点，几乎所有生信分析都可以靠一下~）

Figure5 

展示了ATG5在多种肿瘤中与免疫检查点的相关性情况

Figure6 

肿瘤微环境（TME）和微卫星不稳定性（MSI）

Figure7 

ATG5与DNA修复相关基因和甲基化的相关情况

Figure8 

最后进行GSEA分析

两个表格展示了GSEA富集到KEGG/HALLMARK的top20条目

本文数据量并不是很大，思路也很简单，现在如果加一些简单的实验完全是可以发的。我们先来进行复现，复现过程中我们会额外补充一些零代码出图的分析，最后还会分享泛癌补实验的技巧。

复现步骤

我们还是以生信分析神器：仙桃工具为主进行复现.

进入仙桃学术主页,点击“生信工具”

【高级版】 → 【立即使用】（注：免费版和基础版都可以进行统计和可视化，由于高级版功能最全，这里选择高级版作为范例）。

首先我们来复现表达差异的结果。

在左侧菜单栏“表达差异（挑）”模块进入，选择“表达差异”菜单，下拉有“非配对样本”和“配对样本”两种选择

我们以非配对样本为例，点击进入页面后，选择“泛癌”疾病数据集，向右拖拽可以看到正常vs肿瘤，或者癌旁vs肿瘤。

右侧参数部分输入分子，这里输入“ATG5”，点击“确认”进行绘图。

结果还不错，虽然表达差异倍数不是很大，但是在多数肿瘤中升高还是具有统计学意义的。

结果这里提供多种格式进行下载，“保存结果”可以上传到历史记录中，可直接用于后续拼图。

好用的拼图功能已经多次详细展示了，这里就不再重复了，还不会的小伙伴可以查看之前的推文，有详细操作过程~

分析基因在正常组织/正常细胞中的表达情况

我们使用的是HPA数据库（https://www.proteinatlas.org/），我们还可以利用该数据库增加一些原文没有的分析结果，一起来看看吧。

进入首页后，在检索框中输入主变量分子，点击“Search”进行检索。

由于只是基本检索，结果会显示所有模糊检索到的内容，但一般第一条就是我们想要的基因。

点击“Tissue”，可以查看ATG5在正常组织中的表达情况：

点击“Cell Type”，可以查看ATG5在正常细胞中的表达情况：

将上述图片进行拼图即可完成第一张图片。

此外，我们还可以“顺手”增加一点分析。

还是HPA数据库刚才的页面，点击“Pathology”，进入后向下翻，找到“PROTEIN EXPRESSION部分”，这里显示了多种癌症组织的免疫组化结果。

关于HPA数据库就不过多介绍了，解螺旋官网单元课中有该数据库的详细免费教程，感兴趣的小伙伴可以去学习一下~

接下来是预后分析，回到仙桃工具，左侧目录中点击“临床意义（靠）”中的“预后分析”，展开后进入“KM曲线图”

由于仙桃工具有记忆功能，所以分子不需要重复输入。不过这里不能直接选择泛癌，我们需要多次更换疾病。

这样我们就可以获得HR和P值。

当然，我们可以将结果保存或者下载，拼图后就是原文的Figure3

当我们在所有癌种中分析完，可以得到ATG5在各个癌种中的HR和p值，进入“基础绘图”菜单，找到“森林图”点击进入。

这是需要上传数据的，一般我们会下载示例数据，然后按照示例数据格式，将我们的数据进行整理，如下

这样我们就得到了原文的Figure2，如果不喜欢默认风格可以在右侧参数部分进行更改。

接下来是免疫浸润分析，在“交互网络（联）”中有“免疫浸润”，下拉后选择“散点图”。

点进去还是一样的风格，分子是输入好的，然后不断变换疾病即可

如果想改变默认风格可以在右侧参数中修改，鼠标点一点就能实现，十分方便。此时我们可以保存结果，后面直接用仙桃工具拼图，也可以下载PDF或者TIFF格式文件进行保存。

这里默认展示T细胞的浸润情况，在参数中有一个“算法参数”栏，里面可以选择细胞，可以按照原文选择，也可以都进行分析，最后选出比较好的结果进行展示。

提到免疫浸润，我们就再多讲一点，这里还可以增加一些分析，丰富文章内容。刚才复现原文使用的是“散点图”模块，我们可以再看一下“棒棒糖图”

通过调整参数，我们可以得到横向的免疫细胞浸润棒棒糖图。

这么好看的图片放在文章中一定会为文章增色不少。

其实仙桃工具还有“分组比较图”模块，感兴趣的小伙伴可以试一下，也是一键出图，十分方便~

接下来我们继续复现Figure5，ATG5在泛癌中与免疫检查点基因的相关性热图。

如果要完全复现这张图，首先我们要获得相关系数。还是在“交互网络（联）”中，下拉“分子相关性分析”菜单，找到“单基因共表达热图”点击进入

在右侧参数的“分子列表”中输入免疫检查点基因，点击确认出图。

可以得到ATG5在单一肿瘤中的相关性热图。页面继续向下翻

在结果说明中，显示了分子-分子相关性情况，其中有ATG5与其它分子的Pearson系数和Spearman系数以及对应的p值，可以保存这些数值绘制相关性热图。

在“基础绘图”中找到“相关性热图-相关矩阵”，按照示例数据格式将刚才保存好的数据整理好

首先输入的是Pearson系数或者Spearman系数，也就是相关系数

在子数据表位置可以选择“p值”的子数据表，然后将对应的p值输入

上传数据验证成功后，点击“确认”进行出图。

在右侧可以调整参数，得到个性化的结果图片。

对了，基础绘图的大部分模块都有相应的训练营，可以联系仙桃班主任进行报名~

接下来是TME和MSI的雷达图，目前仙桃工具可以绘制雷达图，但是还没有上线TME和MSI泛癌的在线分析，如果大家有相关数据，可以进入“基础绘图”中，点击“雷达图”进入

我们先来上传示例数据出图，看一下可以得到什么样的图片。

这里可以得到三个基因在多个分组中的相关性情况，如果只输入一个基因，将分组换成泛癌即可得到原文中的图片，敬请关注仙桃工具后续更新

接下来是Figure7，ATG5与DNA修复相关基因在泛癌中的相关性，与刚才免疫检查点基因类似，只要将分子列表更换一下即可，这里就不再重复演示了。

这里第二张小图是ATG5在泛癌中甲基化的情况，这里我们没有完全复现，但是可以利用仙桃工具展示更多更美观的图片

在“交互网络（联）”中可以看到“DNA甲基化”，下拉菜单，点击“分子表达相关性”

选择疾病的位置没有变，不过输入分子的框在疾病的下方，输入分子名称和探针，这里可以逐个输入探针，选择结果比较好的进行展示

这样就可以得到ATG5在各个肿瘤中甲基化的相关性结果，最后筛选结果比较好的图片拼到一起展示即可

最后我们来看一下Figure8，GSEA富集分析。

原文是根据ATG5的表达高低分组，然后找出差异基因，接下来对这些差异基因进行GSEA富集。

这一点仙桃工具也可以零代码轻松实现，不过由于仙桃工具的这个模块目前还没有收录泛癌的数据，所以我们需要分别获取数据，最后整理到一起

选择“表达差异（挑）”，下拉“差异分析”菜单，点击“单基因差异分析”进入

分子仍然不需要输入，只需要选择疾病，我们这里随机以宫颈癌为例进行演示，点击“确认”提交分析

该分析结果需要一点时间，但一般3-5min就可以了

喝杯茶的功夫再点击上方的“历史记录”查看，分析已经完成了

也是有多种格式可供下载

下载后查看一下，可以看到差异基因表很全，gene symbol、ensembl ID、logFC、padj。

其实GSEA分析只需要输入gene symbol和logFC即可。

接下来我们可以用同样的方法分析多种癌症的ATG5分组的差异基因，汇总后可以直接去掉重复值，也可以将重复值的logFC取平均值

之后进行GSEA富集分析，仙桃工具可以一键分析 可视化出图。

进入“功能聚类（圈）”，下拉“GSEA富集”，首先点击“GSEA分析”

整理数据，id这列是gene symbol，value可以输入logFC值

将整理好的数据上传，右侧参数可以选择默认

点击确认提交后，这个分析也大概需要1min的时间即可完成

完成后在历史记录中可以下载完整的GSEA表格，即为原文中的table。

继续进行GSEA可视化可以直接点击左侧菜单栏的“GSEA可视化”

进入后直接即可看到刚才进行的GSEA富集分析，点击“确认”进行可视化出图

如果想要改变可视化的条目，可以在右侧参数部分进行设置

在参数的“基本参数”中可以填写“基因集ID”，可以在刚才保存的GSEA富集分析结果中选择想要展示的条目粘贴到这里

如果我们想要对比多个结果的话，可以进行山峦图可视化。

仍然是在GSEA富集模块，工具不久前更新的“GSEA山峦图”

点进去的界面与GSEA可视化相同，直接点击“确认”

就可以得到非常漂亮的山峦图了，可以与上一步得到的可视化图片联合展示

到此我们复现结束啦，本文工作量不是很大，在复现过程中又给大家推荐了几个可以增加的内容，使用仙桃工具都可以轻松出图。

最后和大家分享一下泛癌如何补实验~

其实泛癌的文章并不需要将所有癌种的实验都做到，只要做其中典型的几种就可以。

比如挑选表达差异结果比较高的癌症，最简单的就是在临床收一些癌vs癌旁的组织，可以提取RNA进行qPCR检测，或者做免疫组化；

还可以选一些细胞系，不需要任何操作，养起来就直接收细胞检测目的基因的表达，不过需要正常细胞系作为对照。

如果稍微复杂一点的，可以构建敲低/过表达质粒，转入细胞（转染、感染均可）后做些简单的功能实验，比如CCK8检测增殖、流式分析细胞周期等等。

我们也推出了许多仙桃工具相关的训练营，包括但不限于基础班训练营、高级版训练营、文章复现训练营、分模块教学的快闪营、写作工具训练营等等，还没有入手高级版的小伙伴们不要犹豫了，早买早发文，也祝大家早日发表属于自己的生信文章！

END

6 纯生信老套路复现流程太详细了吧~

自己也想成为套路的王者，如何能学到这套路呢？

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