移码敲除和片段敲除该怎样选择？

无论是移码突变还是片段敲除的策略，均能实现目的基因的彻底敲除，两种方法各有千秋，但都不是完美的，均存在一定的局限性。例如在采用移码突变进行敲除的过程中，基因可变剪切的关键位点可能发生突变而产生新的转录本；蛋白翻译时可能跳过突变的起始密码子，以其他AUG为起始密码子重新启功翻译等。另外，如果选择的敲除位点相对靠后，而抗体与蛋白的结合区域若存在于敲除位点之前，便可能会出现抗体与N端残留蛋白的结合，从而导致Western Blot检测条带，出现假阳性结果。而片段敲除策略同样会有蛋白残留的风险，且敲除效率也会由于使用了两条gRNA以及敲除片段长度而降低，另外会因突变基因型繁多而增加的难度 、检测成本与时间等。

我们做细胞基因敲除并不局限一定要用哪种方法，比如移码突变，我们可通过优化sgRNA设计来避免蛋白残留风险。在设计sgRNA时注意脱靶风险和切割效率等常规参数，并且结合相关的文献报道和数据库，关注起始密码子位置、影响可变剪切的位点、转录本数量等相关参数来选择要打靶的位点或区域。同时选择特异性高的抗体开展Western Blot检测，便能取得较好的实验结果。

下面以一个案例进行介绍。我们为了敲除基因CARM1，首先查阅了CARM1的所有转录本（图4A）。在考量完所有的影响因素后，在2号外显子处设计sgRNA以开展移码敲除（图4B）；在2号外显子前端和4号外显子后端处设计sgRNA以开展片段敲除（图4D）。在构建好移码敲除和片段敲除的CARM1敲除细胞系后，分别对两种细胞系进行Western Blot检测。从检测的结果来看，移码敲除和片段敲除策略构建的CARM1敲除细胞系均无表达CARM1蛋白，说明CARM1已经被敲除（图4C、E）。

图4. 使用移码敲除和片段敲除策略构建CARM1的敲除细胞系

（A）CARM1转录本示意图（B）移码敲除策略示意图（C）移码敲除策略构建的CARM1敲除细胞系WB检测结果（D）片段敲除策略示意图（E）片段敲除策略构建的CARM1敲除细胞系WB检测结果