一作解读|小麦叶锈菌保守结构效应蛋白的全基因组筛选

小麦叶锈病是严重威胁全球小麦生产的重要真菌病害,具有发生范围广、频率高、危害严重等特点。小麦叶锈菌(Puccinia triticina)的成功侵染与定殖,依赖于自身分泌多种效应蛋白抑制寄主防卫反应。一般认为,锈菌通过特殊结构“吸器”,向吸器外间质分泌效应蛋白,而部分效应蛋白需要进一步转移至植物细胞内以抑制相应植物靶标。病原卵菌和真菌效应蛋白中存在RXLR、LFLAK-HVLVxxP (CRN)、 Y/F/WxC、CFEM、LysM、EAR、[SG]-P-C-[KR]-P、DPBB_1 (PNPi)和ToxA等多种蛋白保守结构,参与效应蛋白的跨膜转运或行使基因功能。然而,小麦叶锈菌中具有各类保守结构的效应蛋白仍不明确。

本研究对小麦叶锈菌毒性小种PHTT(P)夏孢子萌发样品,以及感叶锈病小麦品种“中国春”接种PHTT(P)后4、6、8 d的叶片样品进行了RNA测序。利用小麦叶锈菌“Pt 1-1-BBBD Race 1”参考基因组进行转录组拼装,共注释了17,976个基因,包括2,284个新转录本。通过基因差异表达分析,发现小麦叶锈菌侵染过程中有3,149个基因在不同侵染阶段均显著上调表达,而有1,613个基因在锈菌孢子萌发阶段表达量较高。侵染阶段上调表达基因GO注释富集于“氧化还原酶活性”生物学过程,并具有“细胞外”亚细胞定位。而上述3,149个侵染诱导的差异表达基因共编码了464个分泌蛋白,其中79个分泌蛋白被EffectorP进一步预测为效应蛋白。

综合利用hmmsearch、Regex和同源蛋白比对,我们从全基因组水平鉴定得到719个RXLR-like、19个CRN-like、138个Y/F/WxC和9个CFEM小麦叶锈菌效应蛋白。其中,RXLR-like效应蛋白符合病原卵菌和其他真菌中发现的广义RXLR模型“[RKH]X[LIMFYWK][RALQGTF]”,并有10个效应蛋白具有较为完整的RXLR-DEER-like蛋白基序。
本课题组前期研究发现,小麦锈菌中存在毒性效应蛋白PNPi,可通过靶标小麦NPR1蛋白抑制植物系统获得抗性。该效应蛋白N端信号肽后具有RXLR-DEER-like基序RSLL-DEEP,而在蛋白C端具有DPBB_1保守结构域(PF03330)。本研究发现小麦叶锈菌中存在19个具有DPBB_1保守结构的PNPi-like分泌蛋白。我们对其中的12个侵染期诱导表达的PNPi-like效应蛋白基因进行了克隆,并利用酵母双杂交系统测试了上述PNPi-like效应蛋白与小麦NPR1蛋白的互作情况。结果表明,包括PNPi在内,共有4个PNPi-like效应蛋白可与小麦NPR1蛋白相互作用,推测具有相似的抑制麦类作物系统获得抗性的功能机制。
利用qRT-PCR技术,我们对部分效应蛋白在转录组文库中的表达谱进行了验证。其中, PtY/F/WxC_PTTG_11739和PtPNPi_PTTG_03809分别在叶锈菌侵染前期和中后期显著诱导表达,而PNPi-like_PTTG_00399和PtY/F/WxC_PTTG_11693在孢子萌发阶段表达量较高。这些结果与转录组文库中FPKM值预测的基因表达模式一致。
进一步选取了9个Y/F/WxC和7个CFEM效应蛋白进行功能初探。利用烟草基因瞬时表达系统对上述效应蛋白基因进行表达,发现瞬时表达CFEM效应蛋白基因PTTG_08198可诱导烟草叶片产生更多活性氧积累,推测该效应蛋白可激发植物基础防卫反应。

本研究利用转录组学方法,初步明确了小麦叶锈菌毒性小种PHTT(P)侵染过程中的转录调控网络。从全基因组水平鉴定得到的差异表达基因和保守结构效应蛋白,将为深入探究小麦叶锈菌致病分子机制奠定重要基础

2020年5月11日,国际微生物前沿期刊《Frontiers in Microbiology》在线发表了题为“Genome-wide identification of effector candidates with conserved motifs from the wheat leaf rust fungus Puccinia triticina”的学术论文,报道了全基因组水平鉴定小麦叶锈菌保守结构效应蛋白的研究,论文收录于“Genomics and Effectomics of Filamentous Plant Pathogens”专题。河北农业大学硕博连读生赵淑清为该论文的第一作者,河北农业大学王逍冬副教授、西北农林科技大学王晓杰教授为通讯作者。论文撰写得到了河北农业大学刘大群教授和西北农林科技大学康振生院士的悉心指导。该项目得到了国家自然科学基金、现代农业产业技术体系、陕西省技术创新团队、河北省优秀青年基金、旱区作物逆境生物学国家重点实验室开放课题等项目的资助。

原文链接:
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2020.01188/abstract
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