【Cell论文拆解】全基因组筛选揭示线粒体代谢和泛素样翻译后修饰在内质网自噬中的关键作用研究
简介
柳华副教授
浙江大学医学院干细胞和再生医学博士生导师。新加坡国立大学博士，哈佛医学院访问学者。从事干细胞免疫原性、组织工程三要素之间相互关系，及对组织再生的影响。在国际知名期刊iScience、Biomaterials、Applied Materials Today、Stem Cell Research and Therapy等发表干细胞、生物材料和再生医学领域相关论文。
文献概述
01
研究背景介绍：
自噬过程会介导细胞内损坏的或冗余的细胞成分进入溶酶体中进行降解以维持细胞稳态。自噬也能特异性地消除整个细胞器，如目前研究比较多的线粒体自噬。自噬过程中任何一个环节失调都可能对细胞产生不良影响，引起各种疾病。研究表明线粒体自噬相关基因（PINK1和Parkin等）突变就是帕金森病的发病原因之一。内质网（ER）在体内多种生物学过程中都起到重要作用，如钙的存储、脂质的生物合成、分泌蛋白和膜蛋白的成熟和运输等。因此，ER自噬（ER-phagy）也是机体维持稳态的重要手段。
ER-phagy的研究最早可追溯到15年前酵母中的研究，但是哺乳动物中ER-phagy的研究一直未能取得进展。鉴于在CRISPR筛选技术方面的相关经验，Jacob E. Corn研究组希望通过全基因组CRISPRi筛选来揭开ER-phagy调节相关的信号通路。
02
主要发现：
全基因组CRISPRi筛查出200个ER-phagy相关调节因子。
线粒体氧化磷酸化可以促进ER-phagy。
DDRGK1介导的泛素样翻译后修饰促进ER-phagy。
- 专 家
点 评 -
逻辑亮点：
迄今为止，关于人源细胞ER-phagy的研究不多，对ER-phagy的信号通路及其分子机制更是知之甚少。为了突破这一知识瓶颈，作者们首先借助高通量筛选技术广泛性和系统性的优势，富集出可以激活或抑制ER-phagy的基因，再结合以往的研究、生物信息学和各种生化实验鉴定出其中的关键调节因子，以此为基础进一步借助蛋白质组学技术挖掘上下游分子的相互作用关系，最后成功探索出两种调控ER-phagy的方式：（1）线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）和（2）ER成分的泛素样翻译后修饰（UFMylation）。
可借鉴之处：
1. 为了揭开ER-phagy调节相关的信号通路，作者做了全基因组CRISPRi的筛选，不仅找到了200个与ER-phagy相关的基因，也为今后ER-phagy研究以及相关疾病研究提供了宝贵的数据库。大规模筛选往往是开启全新领域或者找寻课题新思路屡试不爽的方法，而合适的筛选工具（如本文因全基因组敲除筛选可能会影响自噬过程而选用全基因干扰筛选）、合理的对照以及准确的纳入排除标准都会对筛选结果产生影响。除了文库筛选，本文还涉及到相互作用组学和蛋白质组学等技术，这些组学手段也是我们突破科研瓶颈的有利工具。
2. 传统观念中，抑制线粒体OXPHOS会降低细胞能量水平并刺激一般自噬发生。而本文中，作者在ER中发现恰恰相反的现象，利用基因调控或化学调控抑制OXPHOS反而抑制了ER-phagy。更令人惊讶的是，OXPHOS依赖性的ER-phagy是独立于AMP依赖性蛋白激酶（AMPK）的过程。这些，都与这与一般自噬过程完全不同。本文中类似的例子还有，作者们在发现ER-phagy过程中DDRGK1会发生UFMylation修饰后，无论是敲除UFM1还是敲除UFL1之后，都不影响DDRGK1的表达水平和UFMylation修饰。突变DDRGK1中所有保守的赖氨酸位点也不会影响其与UFL1之间的相互作用。最后才发现DDRGK1在ER-phagy过程中不是作为传统的UFMylation底物，而是作为适配器通过招募UFL1来发挥作用的。
不足及值得进一步研究的问题：
1. 本文发现诱导内质网应激（ER stress）的化合物并不会导致ER-phagy，而干扰UFMylation会抑制ER-phagy，从而诱导ER stress和未折叠蛋白反应（UFR）。为何ER stress不会引发ER-phagy，而抑制ER-phagy却能导致ER stress？可能的假设是：在营养耗尽的情况下，ER中的蛋白质错误折叠可能性增加，此时ER-phagy的发生能够将包含错误折叠蛋白的ER消除；如果阻断ER-phagy，可能会导致错误折叠蛋白的堆积，从而激活UPR。验证此假设还需要大量的实验证据，ER减压途径的优先顺序尚待进一步挖掘。
2. 尽管本文首次报道了ER-phagy和线粒体OXPHOS之间的关系，但仍有很多问题悬而未决。线粒体OXPHOS的损伤是通过什么途径抑制ER-phagy？是线粒体-ER的直接接触还是通过其他代谢产物间接进行？抑或是线粒体OXPHOSER通过其他生物学效应间接引发ER-phagy？毫无疑问，细胞器自身内部稳态和细胞器之间的相互联系涉及非常复杂精密的调控，阐明其中的机制还任重道远。
3. 虽然作者们成功解析出RPN1和RPL26是ER-phagy过程中两个重要的UFMylation的底物，但是毫无疑问这两个蛋白不能代表所有的UFMylation过程，其他参与UFMylation的内质网表面蛋白的研究目前仍然一片空白。这些底物蛋白直接存在怎么的关系？是否相互协同来启动ER-phagy？UFMylation之后，RPN1的下游通路仍不明确，从RPN1到IRE1a中间很多调控过程仍未阐明。
4. 虽然以往的报道表明了本文筛选出的一些基因与人类疾病密切相关，尤其是神经退行性疾病，但是草率地将ER-phagy缺陷与人类疾病联系尚为时过早。在大量的疾病模型或病理样本中进一步明确ER-phagy扮演的角色将是未来的研究方向。
- 研 究 逻 辑 路 线 -
Fig 1
问题：目前对ER-phagy相关的调节因子或信号通路知之甚少。
实验验证： 作者们首先确立了细胞ER-phagy发生的刺激条件：16小时的伯爵缓冲盐溶液氨基酸饥饿处理。接着他们在细胞中稳定表达了药物（doxycycline）诱导的ER-phagy串联报告基因系统，当无ER-phagy发生时可观察到ER表现为黄色（ER定位蛋白RAMP4上连接的红色mCherry和绿色eGFP同时表达）；当ER-phagy在溶酶体内发生时ER表现为红色（酸性环境会使eGFP的绿色信号淬灭）（Fig1A）。基于EATR，作者将荧光活化细胞分选方法（FACS）与全基因组CRISPR转录抑制（CRISPR interference, CRISPRi）结合起来进行筛选（Fig1B）。通过筛选，作者们找到了约200个高可信度的ER-phagy相关基因。通过GO（Gene ontology）分选发现自噬和线粒体代谢被高度富集（Fig1C）。这些ER-phagy相关的基因主要可以分为四个类群：（1）自噬执行相关基因（2）泛素化修饰（3）线粒体代谢与氧化磷酸化相关的基因和（4）泛素类似蛋白UFM1相关的蛋白翻译后修饰相关基因（Fig1D）。在亚细胞水平上这些基因又可分为ER基因，自身溶酶体基因和线粒体基因（Fig1E）。
结论：鉴定出200多个与人类ER-phagy相关的基因。
Fig 2
问题：筛选得到的基因很多是线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）相关因子，那么ER-phagy与线粒体代谢之间的关系如何？
实验验证：作者发现ER-phagy所必需的基因在OXPHOS途径中高度集中（Fig2A，蓝点）。干扰OXPHOS不同方面的三个组分：NDUFB2，NDUFB4和ATP5O，发现敲低NDUFB2和NDUFB4能显著抑制饥饿诱导的ER-phagy（Fig2B）；使用同源cDNA重新表达NDUFB2和NDUFB4后能恢复ER-phagy水平，但是交叉使用非同源cDNA时不能恢复ER-phagy水平（Fig2C）。使用小分子抑制剂阻断OXPHOS的不同组分同样能抑制饥饿诱导的ER-phagy（Fig2D），但是却增强了细胞早期（4小时）的一般自噬（Fig2E）。
结论：线粒体的氧化磷酸化过程可以促进ER-phagy。
Fig 3
问题：除了与OXPHOS相关的因子之外，作者们还筛选到了ER相关因子DDRGK1，那么ER-phagy又与DDRGK1有什么关系？
实验验证：筛选到的ER-phagy相关基因中也富集在定位于ER或与ER功能有关的因子，作者重点关注与ER稳态相关的DDRGK1（Fig3A）。敲低DDRGK1能显著抑制饥饿诱导的ER-phagy（Fig3B,C），但是不会影响一般自噬（Fig3C,D）。免疫荧光实验显示DDRGK1与ER共定位（Fig3E）。
结论：DDRGK1特异性促进ER-phagy，但不影响一般自噬。
Fig 4
问题：DDRGK1是以什么方式促进ER-phagy？
实验验证：之前研究表明DDRGK1可以被类泛素化蛋白UFM1进行类泛素化翻译后修饰（UFMylation），UFM1类泛素化修饰包括激活、结合和连接过程，需要E1（UBA5）、E2（UFC1）和E3（UFL1）的参与（Fig4A）。敲低UFL1可以降低DDRGK1的蛋白水平（Fig4B）和ER-phagy水平（Fig4C）；敲低UFM1和UBA5同样可以抑制ER-phagy（Fig4D）。在敲低UFL1的细胞中使用同源cDNA重新表达UFL1可以恢复DDRGK1的蛋白水平和ER-phagy水平（Fig4E,F），但是对该细胞使用DDRGK1的cDNA只能恢复DDRGK1的蛋白水平，不能恢复ER-phagy水平（Fig4E,F）。作者使用不同的ER蛋白（REEP5定位ER tubules，CLIMP63定位ER sheets）发现敲低UFM1或DDRGK1都只特异性的影响ER sheets的自噬（Fig4G）。过表达ER sheets上的自噬受体FAM134B、TEX264和SEC62可以引发显著的ER-phagy，这一过程可被敲低DDRGK1部分阻断；而过表达ER tubule上的自噬受体CCPG1、RTN3L和ATL3不能引起显著的ER-phagy，敲低DDRGK1对该过程也没有显著的影响（Fig4H）。免疫荧光实验显示DDRGK1与FAM134B共定位于ER和溶酶体中，表明DDRGK1参与到FAM134B介导的ER-phagy中（Fig4I）。
结论：DDRGK1介导的UFMylation特异性促进ER sheets-phagy的发生。
Fig 5
问题：DDRGK1是如何介导UFMylation发生的？
实验验证：之前研究表明UFM1对DDRGK1的UFMylation依赖于DDRGK1上的赖氨酸（K）位点（Fig5A）。免疫沉淀实验发现DDRGK1的翻译后修饰的确发生在赖氨酸位点，敲除UFL1或敲低UFM1对该修饰过程均无影响（Fig5B）。突变掉DDRGK1中所有保守的赖氨酸位点不会影响其与UFL1之间的相互作用（Fig5B），且突变掉DDRGK1的Lys267（UFMylation的主要位点）也不影响DDRGK1促进ER-phagy的能力（Fig5C）。免疫荧光发现敲除DDRGK1后，UFL1就无法定位到ER上（Fig5D）。接着作者分别使用不含该蛋白的N端（TM）或C端（PCI）的cDNA去明确DDRGK1蛋白的功能区域，发现去除DDRGK1的PCI结构域之后虽然不影响DDRGK1定位到ER上，但是却影响了其与UFL1之间的相互作用，进一步干扰细胞ER-phagy的发生（Fig5E-H）。免疫荧光发现在线粒体和过氧化物酶体表达DDRGK1可以招募UFL1至这些细胞器（Fig5I）。
结论：DDRGK1通过其PCI结构域在ER-phagy过程中招募E3连接酶UFL1到ER上介导UFMylation发生。
Fig 6
问题：DDRGK1是否是UFM1进行UFMylation的底物？
实验验证：作者使用质谱分析法鉴定DDRGK1蛋白的相互作用蛋白（Fig6A）和DDRGK1依赖性的UFMylation底物（Fig6B）。结果发现除了DDRGK1本身和UFL1，几种核糖体亚基蛋白也与DDRGK1相互作用密切（Fig6C）。而通过比较UFSP2单敲细胞和DDRGK1/UFSP2双敲细胞的UFMylation，发现了几种被类泛素化翻译后修饰的蛋白被富集出来，包括RPL26（已知的UFMylation底物蛋白）和RPN1（位于ER的OST复合物的亚基）（Fig6D）。构象发现RPN1的胞浆区结构特点可能是其作为新型UFMylation底物的基础，且RPL26和RPN1在构象上也紧密相邻（Fig6E）。免疫沉淀和免疫印迹证实RPL26和RPN1在ER-phagy过程中被类泛素化翻译后修饰，而这一过程可被敲低DDRGK1所阻断（Fig6F,G）。
结论：DDRGK1不是是ER-phagy过程中UFM1修饰的底物，而是作为UFL1适配器来发挥作用的。
Fig 7
问题：ER-phagy发生对细胞起到什么作用的？
实验验证：作者们在多种细胞类型（HepG2、MCF7和HeLa 细胞）中均发现敲低DDRGK1或UFL1或UFM1会导致IRE1a蛋白水平升高，也会导致其他几种未折叠蛋白反应（UPR）相关蛋白水平升高，包括BiP和CANX；此外也观察到CLIMP63 （ER sheet marker）和REEP5（ER tubule marker）蛋白水平的升高，这些结果表明ER扩张的发生（Fig7A）。同时，敲低DDRGK1或UFL1也能上调UPR markers的转录水平，但IRE1a转录水平没有明显变化（Fig7B）。敲低IRE1a不影响ER-phagy的发生，但是能稍微恢复DDRGK1缺失细胞的ER-phagy能力（Fig7C），即UFMylation所致的ER-phagy是IREa通路的上游信号。总之，在富含核糖体的ER sheets上，DDRGK1招募UFL1对RPN1等底物进行UFMylation修饰，导致ER-phagy的发生，进而抑制IRE1a介导的UPR（Fig7D）。
结论：ER-phagy发生可以抑制IRE1a介导的UPR。