百里香酚的功能及其在动物生产中的应用
百里香酚的功能及其在动物生产中的应用
窦秀静, 房春洋, 皇甫迎旭, 单安山
Function of Thymol and Its Application in Animal Production
DOU Xiujing , FANG Chunyang , HUANGFU Yingxu , SHAN Anshan
Abstract：Thymol is a natural phenolic substance isolated from thyme and oregano, it is mainly used in traditional medicine, food and cosmetic industries. In recent years, thymol has received much attention as a potential and safe alternative to feed antibiotics. Therefore, this article reviews the role and mechanism of thymol in antibacterial, anti-inflammatory, antioxidant and immune, as well as its application in the production of different types of animals, in order to provide a reference for its future in-depth research and comprehensive development and utilization.
随着人民生活水平的不断提高，人们对肉类的需求越来越大，使得企业不得不采取工业化集中养殖模式，但高密度养殖易造成疾病传播。一般而言，为避免动物疾病，会在饲料中添加大量具有抑制作用的抗生素，以达到预防性治疗的目的，但是长期使用抗生素会导致某些细菌产生抗药性，还存在药品残留问题，这些残留在动物产品中的抗生素或其产物对人类健康会造成很大的威胁。2020年我国饲料中全面禁止使用抗生素，以维护动物源食品安全和公共卫生安全。因此，抗生素安全替代品的开发刻不容缓。研究发现，百里香酚具有抗菌、抗炎等活性，可广泛应用于动物养殖业中。目前，百里香酚已被欧盟委员会认定可作为食品中的调味剂，且被美国食品药品管理局认定为公认安全的食品添加剂。由此可见，百里香酚具有成为抗生素替代品的极大潜力。
百里香酚全称为5-甲基-2-异丙基苯酚(5-methyl-2-iso-propylphenol)，是一种从唇形科植物的挥发油中提取出的单体物质。一般为无色或白色的晶体物质，分子式为C10H14O，相对分子质量为150.22，相对密度为0.979，微溶于水，易溶于有机溶剂，熔点为51.5 ℃，沸点为232.5 ℃。因其主要是从百里草中提取分离，故名为百里香酚。
2.1 抗菌作用
大量研究结果揭示了百里香酚或含百里香酚的植物都具有显著的抗菌活性，且百里香酚具有广谱性，对大多数革兰氏细菌有抑制作用。常见有沙门氏菌、百日咳杆菌、紫色色杆菌等革兰氏阴性菌，以及金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌等革兰氏阳性菌。但是百里香酚对不同细菌的作用机理各不相同。例如，Qiu等研究发现，百里香酚抑制金黄色葡萄球菌中α-溶血素、肠毒素A(enterotoxin A，SEA)、肠毒素B(enterotoxin B，SEB)的转录，导致他们的分泌量减少，从而降低了溶血和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)的诱导活性。Barbosa等利用未处理的对照组和具有亚致死浓度的牛至精油、香芹酚和百里香酚处理的试验组进行对比，研究表明抗菌活性优先与百里香酚的存在有关，且百里香酚在DNA合成和蛋白质调节方面可起到干扰作用。Upadhyay等通过体内试验检测到百里香酚能在一定程度上降低单核增生李斯特菌的毒性，还能增强抗菌肽基因的表达能力，提高生命的生存能力。Dong等研究发现，百里香酚在亚抑制浓度下可以通过抑制嗜水气单胞菌基因的转录而显著减少溶气素的产生和生物膜的形成，说明百里香酚具有抗群体感应活性。同时，Caceres等表示百里香酚-香芹酚-化学型油是进一步研究抗生素设计和开发抗细菌耐药性的最佳候选者。总之，百里香酚可以通过抑制细菌中毒性物质的转录和翻译，增强动物机体内某些抗菌基因的表达以及抑制细菌生物膜的形成，从而发挥抵抗细菌的作用。
此外，百里香酚可以与其他物质共同作用增强抗菌活性。比如百里香酚可作为抗生素佐剂和抗生素结合。Kissels等研究发现，百里香酚对百日咳杆菌和溶血支原体的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)分别为1.250和0.625 mmol/L，当它与多西环素或替米考星合用时，经分数抑制浓度棋盘检测其抗菌作用，结果显示百里香酚与抗生素共同作用杀菌效果显著增强。百里香酚可与香精油中挥发性化合物结合，Porter等发现白芥子挥发油与百里香酚共同抑制沙门氏菌，降低了抑制沙门氏菌所需的精油浓度，且具有一定的商业价值。百里香酚还可与噬菌体结合，与单独使用百里香酚或噬菌体相比，可以大大减少鸡肉制品中沙门氏菌的数量。
百里香酚还可以抑制真菌细胞的生成。真菌的细胞壁和细胞膜对细胞的正常生命活动有重要作用。真菌细胞壁的主要成分为脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，百里香酚可通过抑制脂多糖的释放破坏细胞壁的正常结构，发挥抗菌作用，并且对较低水平的几丁质细胞壁的抗性更强。真菌细胞膜的主要成分为麦角固醇，百里香酚会改变细胞膜的通透性进而影响细胞膜的完整性(图 1)。Ahmad等通过试验研究了百里香酚对细胞生长和氢离子外排的抑制作用，表明百里香酚的抗真菌活性与氢离子-ATP酶的抑制作用有关。总之，百里香酚通过破坏真菌类细胞膜或细胞壁的正常结构起到抑菌的效果，并可与细胞壁或细胞膜干扰剂联合应用，进一步有效抑制真菌生长或绕过真菌对药物的耐药性。
图1：百里香酚的功能图
Fig. 1 Function diagram of thymol
2.2 抗炎作用
炎症是由多种信号分子介导的复杂病理生理过程，信号分子由白细胞、巨噬细胞、肥大细胞等多种细胞产生。对于巨噬细胞而言，炎性过程主要通过核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路调节。因此，抑制细胞中的NF-κB和MAPK信号传导是抑制炎症反应的重要靶点(图 1)。NF-κB是一个转录因子，可激活大量的促炎症基因(细胞因子、趋化因子、黏附分子)的表达，在氧化应激、炎症和免疫反应中起重要作用。De Jesús等通过试验说明NF-κB/Rel转录因子家族在炎症反应的起始和消退中起着核心作用，确定了NF-κB的亚基c-Rel转录因子为炎症基因的转录阻遏物。经研究发现，百里香酚能抑制NF-κB信号通路，进而抑制TNF-α和支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)的产生，同时促进红系衍生的核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)的表达。此外，百里香酚还能显著降低Fos蛋白(c-Fos)、活化T细胞核因子1(NFAT1)、活化T细胞核因子2(NFAT2)的表达，并且在蛋白水平上，会诱导应激活化蛋白激酶和信号传导及转录激活蛋白磷酸化水平下降，从而起到抗炎作用。总之，百里香酚通过抑制细胞中的NF-κB和MAPK信号传导，降低或阻止毒性蛋白或毒性物质的产生，达到抗炎的效果。
对于一般的炎症疾病，如风湿性关节炎、胸膜炎、腹膜炎等，百里香酚均具有抗炎、促愈合功能。其中对山羊子宫内膜炎症抑制的安全浓度为100 μg/mL，此浓度范围内百里香酚可抑制山羊子宫内膜细胞的炎症作用，减轻细胞的结构性损伤，但高于此浓度会显著增强山羊子宫内膜细胞的通透性，损伤细胞。
2.3 抗氧化作用
氧化应激会对动物产生免疫抑制、减缓动物生长、降低生产性能以及引起脏器损伤等不良影响，其主要的细胞介质是多形核中性粒细胞(polymorphonuclear leukocytes，PMNs)，激活的PMNs会产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，ROS的分泌会引起脂质过氧化、氨基酸氧化、蛋白质裂解和DNA损伤，从而引发自我持续的炎症循环和氧化应激。因此，ROS的释放和PMN的增加都是使机体发生氧化的原因。氧化细胞损伤的治疗策略包括清除特异的毒性效应代谢物、增加特异的细胞内抗氧化系统以及使用具有抗氧化活性的药物。酚类化合物具有氧化还原性质，在中和自由基和过氧亚硝酸盐以及分解过氧化物方面起着重要作用，有关抗氧化活性的数据主要通过2，2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)测定法或脂质过氧化法的化学试验收集。在生物体外，百里香酚通过清除自由基以提高抗氧化能力(图 1)。百里香酚和过氧自由基易发生化学反应，其氢离子与自由基结合，生成中间产物苯氧自由基，快速与下一个自由基发生反应，从而将过氧自由基清除。张有林等[29]通过DPPH测定法研究百里香精油对自由基的清除能力，发现百里香精油对自由基的清除能力与浓度呈线性关系，百里香精油浓度越大清除能力越强，因此可推断百里香精油具有一定的抗氧化作用。
在生物体内，其通过提高生物抗氧化酶活性以提高抗氧化能力(图 1)。Güvenç等通过测定精子质量参数(活力、浓度、异常精子、活死精子比率)和生化参数(还原型谷胱甘肽、丙二醛含量和过氧化氢酶活性等)，并进行组织病理学检测研究不同剂量的百里香酚对精子质量氧化应激和抗氧化系统的影响，确定了使用百里香酚可以调节酶活性，减少氧化损伤，增加动物机体抗氧化水平，并改善精子质量参数。但百里香酚是如何发挥抗氧化作用目前并不清楚，有研究认为，植物精油含有某些抗氧化活性物质能提高机体抗氧化能力，其能与细胞表面受体结合，通过转录和蛋白质表达2个水平使抗氧化酶基因的表达量增加，机体抗氧化酶活性增强，从而提高机体抗氧化作用。
2.4 免疫调节作用
百里香酚具有调节树突状细胞(dendritic cells，DC)生长成熟、增强T细胞活性、诱导细胞增殖、影响炎症反应等免疫调节作用。在现代医学和农业生产方面具有一定范围的应用。Gholijani等研究发现，百里香酚可通过调节端激酶(c-Jun N)、信号转导子和转录激活因子降低炎性细胞因子IL-1β、TNF-α、激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)和活化T细胞(nuclear factor of activated T cells，NFAT)基因的转录，使白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)的生成受到抑制，从而调节T细胞活性(图 1)。Palabiyik等通过在细胞培养基中分别添加25、50、100 mmol/L的百里香酚，对比发现，3种浓度均可提高细胞活力，并记录到100 mmol/L的百里香酚在24 h时效果最好，活性最强。同时Amirghofran等的研究发现，百里香酚还能抑制同种异体T细胞应答，并且可以促进DC的成熟。DC是免疫系统中最有效的抗原呈递细胞，可分为未成熟DC(immature DC，iDC)、半成熟DC(semi-mature DC，sDC)以及成熟DC(mature DC，mDC)。mDC具有激活初始T细胞、抗感染、引发特异性免疫反应等功能，而iDC或sDC可以促进机体产生免疫耐受，是躲避肿瘤免疫杀伤的机制之一。Li等通过试验发现百里香酚对膀胱癌细胞增殖有抑制作用，百里香酚可应用于治疗肿瘤方面。Palabiyik等通过百里香酚与卡瓦酚(carvonol，Car)联合治疗肝癌，发现百里香酚的治疗效果优于卡瓦酚。Chauhan等发现百里香酚不仅是一种良好的有丝分裂原，可使脾细胞的增殖显著增加，而且还能增加膜流动性和增强巨噬细胞的吸收能力，同时也增加了巨噬细胞的溶酶体活性。此外，Ahmed等[38]研究发现，使用百里香油和百里香酚处理阿霉素(doxorubicin，DOX)的大鼠的肾脏和心脏中脂质过氧化作用显著降低，而谷胱甘肽(glutathione，GSH)、酶促抗氧化剂(glutathione enzymatic antioxidant，GST)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)活性显着增加，显著改善了DOX引起的肾脏组织学变化，增强了大鼠的抗氧化防御机制。综上所述，百里香酚提高免疫活性主要是通过缓解炎症反应、增加免疫物质含量和提高氧化损伤能力，但缺乏具体的机制研究，需要进一步有系统的研究。
2.5 其他
目前研究人员正在探究百里香酚对神经活性和内在特性的影响，结果显示百里香酚可激活多种瞬时受体电位(transient receptor potential，TRP)非选择性阳离子通道，其中包括TRPV3、TRPA1和TRPM8通道。TRP通道的调节，尤其是TRPA1，被认为是百里香酚抗伤害性活动的潜在机制。Vatanparast等通过试验研究了百里香酚对白花蜗牛中枢神经元自发活动和动作电位的影响，发现百里香酚(0.5 mmol/L)与钾离子通道阻滞剂四乙基铵协同作用，不能引起蜗牛神经元突发放电，此结果也支持了钾离子通道抑制。
此外，百里香酚还表现出其他几种生物活性，包括促生长、抗伤害、血管松弛素、基因毒性、杀虫等特性。
百里香酚具有抗菌、抗炎等多种功能，且添加到动物饲料中对生长性能、肠道菌群和动物福利都有积极作用。长期反复吸入高剂量百里香酚没有发现慢性毒性。因此，百里香酚在动物饲料生产领域备受关注。
3.1 在猪等哺乳动物生产中的应用
作为一种天然酚类物质，百里香酚能更好的被动物吸收、消化、分解、代谢。在动物生长中能增强抗病能力、改善生产性能、保证产品质量，进而在猪饲料生产中具有良好前景(表 1)。在妊娠晚期和哺乳期观察到系统性氧化应激的增加，使母猪产奶量不足，直接影响哺乳仔猪的健康和生长。饲粮中添加百里香酚可显著增加仔猪的体重和生长速度。为了降低成本，在猪的饲养中普遍应用早期断奶技术，早期断奶会导致仔猪出现“断奶应激综合征”，使仔猪肠道屏障损伤，毒素等物质进入肠道产生免疫应答和分泌细胞炎性因子，使仔猪的消化能力和免疫能力变差。百里香酚具有抗炎和抗氧化活性，可促进断奶仔猪肠道吸收和增强其抗菌活性，有效地改善仔猪肠道微生物菌群。另外，百里香酚和有机酸结合可有效促进肠道黏膜成熟，降低肠道通透性，促进早产仔猪的生长发育，且效果更佳。
3.2 在禽类生产中应用
禽类在养殖过程中，容易感染病毒和细菌而大量死亡，严重时还会影响人类的身体健康。因此，为了降低禽类感染几率、提高成活率和提高产品质量，在禽类养殖中需要一种廉价有效的抗菌物质作为饲料添加剂。百里香酚可从自然植物中提取、来源便利，并且抗菌效果显著，所以可作为禽类饲料添加剂使用。杜恩存、魏磊等研究得出百里香酚对2种鸡源常见致病菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)均具有抑制作用，且作用效果明显，这与其抗菌活性密不可分(表 1)。与此同时，百里香酚在禽类养殖过程中可用作抗菌剂与肉桂醛共同对脂多糖诱导的肉仔鸡炎症反应起免疫调节功能，主要是影响肠道微生物区系，改善肠上皮屏障功能、缓解产气荚膜梭菌诱导的肉仔鸡坏死性肠炎。此外，在饲粮中添加一定量的百里香酚可提高肉鸡的平均日增重，改善肉质，降低氧化反应。
3.3 在水产动物中应用
在水产动物养殖业中主要的杀菌方式是依靠杀毒剂和抗生素，但长时间的使用会产生细菌耐药性和水体污染等问题。植物精油具有高效的抗菌活性，可用于防治水产动物细菌性疾病。百里香酚、香芹酚、丁香酚和肉桂醛4种常见的植物精油成分中，百里香酚的杀菌效果最明显。研究发现，百里香酚作为饲料中的诱食剂，在诱食、促进摄食、改善肉质等方面发挥积极作用，可促进虹鳟生长、提高增重率及降低饲料系数；提高罗非鱼生长性能，增强脂肪酶活性(表 1)。同时，饲料中添加一定量的百里香酚会使黄颡鱼体重迅速增加，其主要原因是对神经肽(neuropeptide Y，NPY)mRNA表达产生影响。鱼类在饥饿状态下，其脑部中的NPY mRNA表达量较饱食状态下明显增加，呈现出强烈的摄食欲望，从而促进摄食能力。
百里香酚是一种纯天然的植物提取物，具有抗菌、抗炎、抗氧化等多种活性，在动物生产中具有很大潜力。但有研究发现，百里香酚对动物皮层和黏膜等组织有刺激作用，浓度过高还会损坏肝脏和肾脏，因此使用时需注意用量。此外，由于环境等因素的限制，天然百里香酚的成本很高。目前主要依靠间甲酚和丙烯或异丙醇等经傅-克烷基化反应人工合成，在生成百里香酚的同时也产生很多副产物，如2-异丙-3甲基酚、4-异丙基-3-甲基酚和3-甲基苯-异丙基醚等，均具有一定毒性，若处理不当会严重污染环境。但现在已有研究出百里香酚的最佳工艺条件为：以平均孔径为7.48 nm的大孔γ-Al2O3为催化剂，反应温度为250 ℃，间甲酚与丙烯的摩尔比为1:2，空速为0.87 mL/(g·h)，在此条件下，百里香酚获得最大生产率为73.0%。希望通过不断的探索和完善，百里香酚能早日大规模投入生产中，实现其在动物生产中的广泛应用。
来源：动物营养学报