微生物合成的可降解塑料 -聚羟基脂肪酸酯（PHA）百年历史

随着社会发展和人民生活水平的提高，塑料制品已成为人们生活中不可或缺的一部分，然而利用化石资源生产的聚乙烯（PE）等传统塑料的大量使用也造成了严重的环境污染。由于聚羟基脂肪酸酯（PHA）的可再生、无污染、可降解、结构多样性等特点，已逐渐发展成为传统塑料的替代品，被称为“绿色塑料”，本文将从PHA种类、特性、代谢途径改造、产业化生产等不同方面系统介绍过去100年里PHA的发展历史。

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合成PHA微生物的发现

1926年，Maurice Lemoigne在巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）中发现PHA的一种，聚3-羟基丁酸（PHB），同时Lemoigne确定了PHB是3-羟基丁酸（3-hydroxybutyrate, HB）的均聚物。

PHA在微生物体内主要是作为细胞内碳源和能源的储藏物质而存在的，目前已在不同微生物体内发现不同的PHA合成相关的酶，这些微生物包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和古菌，它们可利用不同碳源通过糖酵解、脂肪酸氧化等多种代谢途径合成PHA。

革兰氏阴性菌是合成PHA的主要微生物。不仅能合成短链PHA（scl-PHA），也能合成性能更好的中长链PHA（mcl-PHA），这类微生物合成产物的多样性扩大了PHA的应用范围，同时也为大规模生产带来了可观的经济效益，其中Azohydromonas、Burkholderia、Cupriavidus necator、Pseudomonas、Halomonas等微生物是常见的PHA合成菌株，这类菌株可利用低成本的不同碳源合成PHA。Cupriavidus necator不仅能利用葡萄糖、果糖为碳源发酵高效合成PHA（约占细胞干重80~90%），还可以利用CO2、废弃油脂等成本更低的碳源高效合成PHA。野生型的Cupriavidus necator是工业生产PHA中多种聚合物最常用的微生物。与Cupriavidus necator相似，野生型Alcaligenes latus也可用于PHA生产，并且已被Chemie Linz AG，Austria Biotechnologische Forschungsgesellschaft (btF, Austria)和Biomers (Germany)用于生产PHB和PHBV，实验室水平发酵18h就已达到50%（CDW）PHB生产能力。

由于Pseudomonas不仅能利用多种底物合成PHA，而且能够代谢合成更高价值mcl-PHA，因此这些微生物被PHA生产行业视为最具吸引力的候选菌株，据报道，野生型的Pseudomonas oleovorans以正烷烃为底物时以1.06g/l/h的生产能力合成占细胞干重（CDW）64%的mcl-PHA，较广泛的底物可选择性和PHA合酶（PhaC）的低底物特异性使P. oleovorans和P. putida能通过不同的单体合成超过100种PHA[4]。另一种已被应用到工业生产的微生物Aeromonas hydrophila可用于生产共聚PHA，在20000L发酵设备中发酵46h时的生物量、PHA含量分别为50g/l和50%（CDW）。

革兰氏阳性菌多用于合成scl-PHA。常见的微生物包括Actinomycetes、Bacillus、Caryophanon、Corynebacterium、Micrococcus、Rhodococcus等。其中Bacillus具有较强的PHA生产性能，最常用于研究合成PHA。Geethu等利用Bacillus endophyticus，以甘蔗糖蜜为碳源能合成10.7g/L的PHA。Bacillu cereus PHA 008利用棕榈油厂废水能生产64.09%（CDW）的3-羟基丁酸（3HB）和3-羟基戊酸共聚酯[P(3HB-co-3HV)。

古菌也能在极端环境下利用淀粉、乳清水解物、酒糟和甘油为底物生产PHA。

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PHA大家族性质多样、应用广泛

2.1 PHA的种类繁多

PHA是由3-羟基脂肪酸（3-hydroxyalkanoate，3HA）单体组成的线性聚酯，其分子量一般为50~1000kDa，PHA结构通式如图一所示。自从PHB被发现并被确认为第一个PHA，到20世纪70年代，除3-羟基丁酸外的其他单体相继被发现，例如3-羟基戊酸（3-hydroxyvalerate, 3HV）于1974年被发现，随后，在微生物合成的PHA中发现了3-羟基己酸（3-hydroxyhexanoate, 3HHx），3-羟基辛酸（3-hydroxyoctanoate, 3HO），和3-羟基癸酸（3-hydroxydacanoate, 3HD）。到目前为止，已经有超过150种PHA被发现，其单体涵盖了从3-羟基丙酸到3-羟基十六酸的广泛范围。同时还有含1~2个双键和带有甲基侧链的羟基脂肪酸,如4-羟基脂肪酸、5-羟基脂肪酸、6-羟基脂肪酸等3-羟基脂肪酸，以及带有其他官能团的3-羟基脂肪酸作为PHA单体的情况。

图1 PHA结构通式

根据PHA单体碳原子数可将其分为两种（图2）：短链（short chain length, scl）PHA，中长链（medium chain length, mcl）PHA。Scl PHA由3-5个碳原子的单体组成，包括poly(3-hydroxybutyrate) P(3HB), poly(4-hydroxybutyrate) P(4HB), poly(3-hydroxyvalerate) P(3HV)，以及共聚物poly (3-hydroxybutrate-copolymer-3-hydroxyvalerate) P(3HB-co-3HV)；Mel PHA由6-14个碳原子的单体组成，包括均聚物，例如poly (3-hydroxyhexanoate) P(3HHx)、poly(3-hydroxyoctanoate) P(3HO)和共聚物poly (3-hydroxyhexanoate-copolymer-3-hydroxyoctanoate) P(3HHx-co-3HO)。通常PHA单体的碳原子数是由PHA合酶的底物特异性决定的。根据PHA中单体的种类又可将其分为均聚物（homopolymer）和共聚物（copolymer）。均聚物只有一种单体，如PHB、PHV等；共聚物含有两种或两种以上的单体，如PHHHx、PHBV等。不同结构的PHA是在与其单体结构相关的底物培养中获得的，这使得合成多种不同结构的PHA成为可能。而根据共聚物的组成方式，又分为共聚和共混两种方式。共聚是指不同的单体连接在同一个碳链骨架上无规则重复而形成的高分子；共混指的是两种以上的同聚物混合在一起形成的混合物。这两种聚合物近年来备受关注，在分子改性方面具有重要意义。

图2 PHA分类

2.2 PHA的性质多样

目前为止，PHA的种类已超过150种，不同种类的PHA具有不同的材料学性质，PHA的材料学性质主要取决于其单体组成，由于PHA单体就已达上百种，因此根据单体的种类和比例能组成成千上万种PHA材料。通常scl PHA结晶度高、拉伸强度低、质地坚硬，特别是自然界中最常见的PHB。然而mlc PHA结晶度低、熔点低、无定形，属于弹性体材料。以PHB材料学性质为例，PHB的组成单位是单一的R型3-羟基丁酸重复单元，是一种热塑性材料，这意味着当温度接近或高于其熔点（Tm）时，它具有高粘性和可模压性。与聚丙烯相比，这两种聚合物具有相同的Tm、结晶度、玻璃化转换温度（Tg）。但微生物合成的PHB由于其完美的立体规整度而使它具有极高的结晶度，较高的Tg和结晶度使PHB成为一种既硬又脆的聚合物，当温度高于熔点时，PHB的分子量显著降低，导致材料加工过程中分子量丢失，从而限制了它的应用范围。

共聚物性质的PHA使其物理性能得到较大改善，例如3HV的参入显著改变了PHBV的结晶结构，降低其硬度、强度和熔点，但分解温度没有变化，改变3HV和3HB的比例可产生不同强度的PHBV材料，例如随着3HV的逐渐增加，结晶规整性下降，呈现不同的结晶形态。虽然mcl PHA是热塑性的弹性体，柔韧性好，但其熔融温度在39℃到61℃，且结晶速率较低，结晶时间可长达几天甚至几十天，这些特点也限制了它作为热塑性弹性体的应用。可通过添加中长链和其他聚合物交联、共混或接枝以改进结晶度、Tm、Tg（表1）。

表1 微生物合成的均聚和共聚物PHA的热力学特征

除了上述的PHA固有特性外，PHA还有生物可降解性和可再生、可循环的特性（图3）。丰富多变的材料学特性以及环境友好的可降解性能使其已无可争议的成为替代传统石化塑料制品的聚合物之一。

图3 PHA的合成与降解

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PHA的生物合成途径

3.1 三步合成scl-PHA

1988年，PHA合成途径的关键基因被发现和克隆，这也标志着代谢工程的开始。PHA的合成途径在罗氏真养菌（Ralstonia eutropha）、拜氏固氮菌（Azotobacterbeijerinckii）等多数微生物中，scl-PHA是从乙酰辅酶A或者丙酰辅酶A开始合成。第一步由β-酮基脂酰辅酶A硫解酶（由phaA编码）催化两个乙酰辅酶A或者一个乙酰辅酶A和一个丙酰辅酶A缩合，产生乙酰乙酰辅酶A或者3-酮基戊酰辅酶A，第二步由依赖于NADPH的乙酰辅酶A还原酶（由phaB编码）催化立体选择性反应，从乙酰乙酰辅酶A或者3-酮基戊酰辅酶A产生（R）-3-羟基丁酰辅酶A或者（R）-3-羟基戊酰辅酶A。第三步依赖PHA聚合酶（由phaC编码）的作用下将（R）-3-羟基脂酰辅酶A单体聚合，产生PHB或者PHBV，同时释放游离的辅酶A。存在于上述微生物中的PHA聚合酶还能利用4-羟基丁酸（4HB）、4-羟基戊酸（4HV）、5-羟基戊酸（5HV）作为底物合成scl-PHA。这一途径是目前研究最多，分布最广的一条途径，在很多不同种属的细菌中都发现了这条途径。

3.2 脂肪酸β-氧化途径

假单胞菌能够利用烷烃、烯烃或者脂肪酸为底物合成单体组成与底物结构直接相关的mcl-PHA。外加长链脂肪酸为碳源时，经β-氧化途径生成各种中间产物，如L-3-羟脂酰辅酶A、烯酰辅酶A、酮脂酰辅酶A等，这些中间代谢物为PHA合成的前体，均可转化为3HA-辅酶A，在P.aeruginosa为代表的的假单胞菌中主要将（R）-烯脂酰辅酶A在烯脂酰辅酶A水合酶（由phaJ编码）的催化下形成PHA的前体（R）-3-羟基脂酰辅酶A，再由PHA聚合酶（由phaC编码）催化聚合形成PHA。1997年，德国Steinbuchel课题组的Qi等人首先将此代谢途径表达到大肠杆菌中。

3.3 脂肪酸从头合成途径

荧光假单胞菌能够从糖基质合成以C10和C8为主的mcl-PHA。糖基质代谢产生的乙酰辅酶A进入脂肪酸从头合成途径，其中间代谢物（R）-3-羟脂酰ACP在（R）-3-羟脂酰ACP：辅酶A酰基转移酶（由phaG编码）的催化下生成PHA的前体（R）-3-羟基脂酰辅酶A（3HA-辅酶A），进一步由PHA聚合酶（由phaC编码）催化生成PHA。

3.4 五步反应合成P（3HB）的途径

深红红螺菌（Rhodospirillum rubrum）可以利用糖基质合成P（3HB）。其代谢途径类似R.eutropha的PHB合成途径，不同的是第二步由依赖于NADH的还原酶将乙酰乙酰辅酶A还原成（S）-3-羟基丁酰辅酶A，然后在两个烯脂酰辅酶A水合酶的催化下，分别经过脱水和水合的过程，转变成（R）-3-羟基丁酰辅酶A，最后聚合成P（3HB）。

3.5 甲基丙二酰辅酶A途径

赤红球菌（Rhodococcus rube）和珊瑚诺卡氏菌（Nocardia Corallina）能从非相关碳源合成含有3HV的PHA。其前体之一的3HV-辅酶A来自一分子的乙酰辅酶A和一分子的丙酰辅酶A，经过类似于R. eutropha途径的硫解和还原途径。利用放射性标记的葡萄糖作为碳源，表明丙酰辅酶A来自于三羧酸循环的中间体琥珀酰辅酶A。糖酵解的产物丙酮酸经羧化形成草酰乙酸，草酰乙酸经过三羧酸循环的逆反应形成琥珀酰辅酶A，再经过异构化形成甲基丙二酰辅酶A，然后脱羧形成丙酰辅酶A。

3.6 依赖于烯酰辅酶A水合酶自脂肪酸合成P（3HB-co-mcl-PHA）途径

豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）利用偶数碳脂肪酸或橄榄油为碳源培养时，能够合成含3HB和3HHx单体的聚合物。Fukui等从Aeromonas caviae中克隆得到PHA的生物合成基因：phaC（编码PHA聚合酶）、phaJ（编码烯酰辅酶A水合酶）和phaP（编码Phasin），三者构成pha操纵子。生化研究表明，PhaJ为（R）-构型专一的烯酰辅酶A水合酶，可将丁酰辅酶A转化为（R）-3-羟基丁酰辅酶A，另外还能将己酰辅酶A转化为PHA前体。因此推测豚鼠气单胞菌合成PHA是从脂肪酸氧化途径中的烯酰辅酶A衍生物开始的。这一合成途径也可能存在于深红红螺菌（R. rubrum）中，因为该菌可以从长链脂肪酸合成以C4或C5单体为主，含有少量C6或C7单体的PHA聚合物。

在目前已知的天然存在的PHA合成途径中，以上述提到的前三条合成途径为主（图4），需要注意的是同一种微生物体内可能存在一种以上的合成途径，例如恶臭假单胞菌（Pseudomonads putida）中至少存在3种合成3-羟基脂酰辅酶A的途径：（1）脂肪酸为底物时的β-氧化途径；（2）脂肪酸从头合成途径；（3）乙酸为底物时的乙酰辅酶A与3-羟基脂酰辅酶A缩合的链延伸反应途径。

图4 PHA主要合成线路

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国内外研究主要团队和主要方向

目前，在PHA领域中、美、欧出现不同的趋势。美国的基础研究逐渐减少，仅有少数公司在致力于PHA的产业化。而欧洲，由于对环境的重视，仍然有许多重大项目的支持，例如欧洲2020地平线项目。并且从PHA产生菌株的筛选，到利用废弃物合成PHA都有研究。同时PHA的产业化以及从塑料的降解到可降解塑料的合成都有涉及，是国际上研究团队最多的区域。

近年来，中国在PHA研究领域的水平发展很快，应该说是处于世界领先的地位，特别是清华大学陈国强教授。他近年提出基于极端微生物利用低成本底物进行持久、连续、开放、节能的PHA生产技术可解决目前生产过程中面临的高成本、低产率、PHA质量不稳定等问题，这一技术也称为NGIB (next-generation industrial biotechnology)。一些极端细菌，例如嗜酸菌、嗜碱菌、嗜热菌、嗜盐菌等微生物均适合用于作为NGIB的底盘微生物。例如，研究发现H. campaniensis在人造海水中可进行连续开放65天的无污染培养。他们通过改造Halomonas spp.可生产PHB、PHBV、P3HB4HB、PHBHHx或者poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhex-5-enoate) (PHB3HHxE)，并且已利用重组H. bluephagenesis从1L扩大到1000L和50000L工业生产PHA，其中在5000L开放的非灭菌条件下细胞密度积累高达100g/L CDW，P3HB4HB含量达到60wt%。

山东大学祁庆生教授团队提出了挖掘葡萄糖作为主要碳源在生物制造中的潜能，将Embden-Meyerhof-Parnas（EMP）途径、磷酸戊糖（PP）途径和双歧途径“bifid shunt”相结合，在构建了“EP-bifido途径”的节碳途径，以葡萄糖高转化率地生产乙酰辅酶A，同时可大大减少CO2的释放，提高PHA的转化率，降低生物可降解塑料的成本。

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PHA产业化过程

自从1981年，英国帝国化学工业集团（Imperial Chemical Industries，ICI）建立第一个PHA中试生产工厂以来，一些公司也逐渐开始进行PHA工业化生产（表2，图5），由于poly(3HB)和poly(3HB-co-3HV)与聚丙烯有相似的材料学性质，因此这些聚合物是主要的合成产品，然而高昂的生产成本限制了大规模的工业化生产进程。随后Monsanto收购了ICI/Zeneca的所有生产专利和版权，尽管Monsanto对微生物合成poly(3HB)和poly(3HB-co-3HV)进行了探索，但是在2004年放弃使用微生物合成方法，转而采用植物生产这些聚合物。然而，到目前为止，Monsanto还没有报道出基于植物合成的poly(3HB)和poly(3HB-co-3HV)商业化生产，原因可能与遗传改造的植物的培养和聚合物产量低有关。

表2 PHA生产公司

图5 PHA生产工厂及其产品

生物合资企业Metabolix公司成立于1992年，通过使用野生菌株和重组菌株已接近应用于商业化生产poly(3HB)和poly(3HB-co-3HV)聚合物（商品名：Mirel），已建立起年产50000吨的PHA生产工厂，目前Metabolix已被韩国CJ公司收购。

Kaneka (Japan)和P&G分别是商业化生产poly(3HB-co-3HHx)和poly(3HB-co-MCL-3HA)的龙头企业，目前，Kaneka仍然专注于合成poly(3HB-co-3HHx)，然而，P&G (P&G PHA商品名：Nodax)的PHA产品技术产权已由Meredian公司收购并更名为Danimer Scientific。Danimer通过重组R. eutropha以脂肪酸为底物生产PHBHHx。

此外，还有几家基于气体发酵合成PHA的公司，成立于2003年的Newlight Technologies可低成本的从甲烷和二氧化碳合成PHA（商品名：AirCarbon）。2010年注册的Mango Materials拥有从甲烷废气生产poly（3HB）的机械设备。

目前，各个国家的公司都在开发可商业化生产的PHA，PHA产品包括poly(3HB), poly(3HB-co-3HV)，和poly(3HB-co-3HHx)，尽管迄今已鉴定出超过160种Has用于组成PHA，但商业生产仅限于几种类型的PHA。对于大多数PHA来说，由于需要使用昂贵的前体和/或微生物菌株的生产性能差导致生产成本高，无法应用于工业生产。由于对于通过微生物合成非天然聚酯的生产仍处于菌株开发的早期阶段，因此现阶段也无法进行工业化生产。生产企业包括Kaneka (Japan), CJ CheilJedang (Korea), BioCycle (Brazil), Biomer (Germany), Mango materials (USA), Newlight Technologies (USA), Danimer Scientific等。

我国已建立起7家PHA生产公司，其中包括已有20多年历史的TianAn，TianAn是现存时间最长的PHA生产公司，GreenBio和Ecomann在艰难的经济环境中勉强生存，最近成立了PhaBuilder，Medpha，COFCO和Bluepha，以探索NGIB的低成本生产PHA，目前大多数PHA生产公司都在尝试开发通过使用各种低成本废弃材料生产PHA，包括厨房垃圾，森林垃圾，农业垃圾等。虽然一些生产公司没有公布所用生产菌株，但大多数公司都使用重组E. coli, R. eutropha或者Halomonas spp.。并且大部分公司都使用CIB（current industrial biotechnology）进行合成PHA，只有三家企业使用NGIB（Next-generation industrial biotechnology）进行产业化生产。

供稿：王苏蒙

编辑：张彤 徐娅 李晓萌

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