质粒小量提取流程及步骤

试剂

悬浮液P1（含100ug/ul的RNase A）

裂解液P2(7×浓度)

中和液P3

洗涤液PW

洗脱液EB（10mM Tris-HCl,pH 8.0,需保持无菌，尽可能新鲜）

步骤

1.12000 rpm离心收集1-5mL过夜培养的细菌，弃去全部的上清。菌体不宜过多，也不宜过少。过多的菌体影响裂解效果，过少的菌体可能导致提取到的质粒总量不足，浓度低。

过多判断标志：加入P2后无法立即澄清，1min后仍无法澄清。

过少判断标志：离心后管壁底部只有薄薄一层菌体，几乎无厚度，肉眼估计菌体体积不大。

2.加入420ul P1,移液器吹打悬浮菌体。

3.加入80 ul P2,立即上下颠倒混匀，此时浑浊的菌悬液应变得澄清透明，若未立即变透明，可短暂放置1-2min，但不宜超过5min。

4.加入350ul P3，立即上下颠倒混匀，此时透明的溶液立即变为白色浑浊。

5.12000 rpm 离心10min，此时白色沉淀于底部和侧壁，转移上清至吸附柱内，注意不要吸入沉淀。（可转移的上清溶液650-750ul）

6.12000 rpm 离心1min，倒掉收集管内的液体，吸附柱放回收集管

7.加入600ul 洗涤液PW, 12000 rpm 离心1min, 倒掉收集管内的液体，吸附柱放回收集管。

8.重复步骤7一次。

9.12000 rpm 离心2min，此步骤为彻底除去洗涤液残留。

10.转移吸附柱到新的1.5mL离心管，打开管盖晾2-5min，残留的乙醇挥发。

11.向吸附柱膜正上方滴入50ul 洗脱液EB,静置2-5min。

12.12000rpm 离心2min。离心管内即为提取的质粒溶液，弃去吸附柱，保存获得质粒溶液。

常见问题与解答

1. 培养物生长不良

保持最佳的空气/容器体积比，培养基在培养管/摇瓶内占体积最大不超过20%。即1L摇瓶最多不超过200mL培养基，15mL培养管不超过3mL培养基。

详细关于质粒提取时培养条件探讨，见公众号相关篇章。

2.菌体过多

导致菌体过多的情况，一是收集了过多的菌体，二是裂解后的P3加入中和步骤不充分。过多的菌体体现在P2加入后溶液无法变得彻底透明澄清，解决方法为减少菌液用量；中和不充分则溶液仍然粘稠，此时增加反复颠倒混匀3-4次有助于增强中和。

3.P2，P3溶液中出现沉淀

运输或放置过程中偶尔有次现象，为了完全溶解，可30-37℃加热10min，颠倒混匀。

4.洗脱液PW

确保使用前加入正确体积的乙醇。由于PW中含有高浓度的乙醇，确保保存期间拧紧瓶盖，防止挥发；使用过程中也需缩短敞开瓶盖的时间，减少乙醇挥发。

5.DNA洗脱

对于大于10kb的质粒，洗脱较为困难，在加入EB后可延长静置的时间至5-10min后再离心。另外，提前加热EB至50℃使用，有助于更好的洗脱。

也可使用pH>7.0的超纯水洗脱，但对于质粒的长期保存，含有pH缓冲剂是更好的选择。

6.纯化得到的质粒有RNA残留

P1中含有100ug/ML的RNaseA,应在4℃保存。如发现降解RNA性能降低或失效，可单独购买RNase A添加。RNaseA也可添加到P3中。

7.基因组DNA残留

不当的操作，如涡旋震荡或者手动摇晃剧烈，会造成基因组断裂为片段，和质粒大小相当的片段将会随纯化而被一起分离。此外，加入P2后过长的碱裂解时间也会造成基因组DNA降解。

不应过度培养。超长时间的培养比新鲜培养的会含有更多的基因组污染。