【衡道丨黑科技】智能化组织切片多光谱定量病理创新解决方案
读完标题是不是有点懵，为了更简单粗暴的记住它，您可以称它为多重荧光免疫组化技术（mIHC）。前面几期小衡通过分享mIHC在不同研究中的应用，让大家对它有了初印象，很多老师纷纷表示很感兴趣，也想利用它在研究工作中大显身手呢。
以往，大家习惯了常规免疫组化的应用，对于新技术的使用难免会产生一些顾虑，很多老师对于技术的应用价值，如何开展实验，以及需要准备什么仍不太清楚。那么本期小衡就带着一些具体问题为大家细细解答......
那么为什么要选择mIHC？
很多人第一反应「它可以在一张片子上同时标记多个指标，省时省力省样本，图片美观」。如果技术也分内在和外在的话，这大概是它最基本的外在表现了。那么它又有哪些吸引研究者的内在优秀品质呢？
不再受抗体种属限制
免疫组织化学染色中为了确保足够的染色强度，应用最多的形式要数二抗间接标记了。为保证多标过程中抗原标记的特异性，必须选择不同种属来源的一抗抗体，以确保二抗对一抗的特异识别。但实际可供选择的抗体种属有限，常规免疫组化很难实现在同一张切片上标记大于3的指标。
而我们的mIHC基于TSA信号放大技术，巧妙利用酪胺分子与抗原蛋白之间的共价结合力远高于抗原、抗体间的非共价结合力，通过微波加热法就可除去一、二抗分子，实现抗原直标。后续若再次使用相同来源的一抗，只需更换标记颜色即可，不用考虑上一轮抗体的交叉干扰。是不是觉得眼前一亮？再也不用纠结一抗不同种属问题了！
解决了染色重叠、荧光干扰问题
我们知道，不同信号在空间位置上的表达会存在重叠现象，以往实现3种酶标显色就相当困难了，特别对于颜色相近的染料混在一起时就越发难以分辨。对于荧光标记显色，利用传统滤光片进行区分存在严重的串色问题以及较强的自发荧光干扰，也限制了多标技术的发展。
我们mIHC结合特殊成像系统，可在420~720nm可见光范围内进行光谱扫描，采集到的高分辨率图像经相机记录整合，再通过样品中已知染料的光谱信息，就可将不同颜色信号拆分出来，形成独立的无干扰的单通道图像。不仅可以实现明场化学染色信号的识别、拆分，还可进行荧光效果转化，是不是很厉害。当然，对于荧光染色样本，不仅可实现7种以上荧光信号的准确拆分，还可去除组织自发荧光，并同样能实现与HE或免疫组织化学样式的明场转换！看完后是不是开始热血沸腾啦？
智能化软件实现了数据标准化
传统免疫组化、免疫荧光图像分析，多为人工判读或者辅以基本图像处理软件，需要耗费巨大的时间精力，判读结果存在较大误差，具有一定的主观倾向性；特别是对于一些复杂的组织类型，不能有效识别。
智能化分析软件的出现将组织识别算法和光谱解读、多标记分析融为一体。软件通过圈选-训练将判读经验转变为客观算法，实现了具有特异性结构的组织区域的识别，更有利于感兴趣区域的精准定量分析。
完美实现组织空间结构分析
组织的空间结构对疾病病理、进展以及治疗反应具有重要影响，大量研究中也体现出肿瘤组织空间背景的研究，对于预测治疗反应的重要作用。
传统IHC有效保留了组织的空间信息，但局限于有限的生物标志物，而测序、细胞流式等技术能分出更多的基因型或细胞型，但却丢失了组织空间信息。mIHC有效解决了这些局限性！另外，相关研究也指出，mIHC检测方案相对于传统PD-L1免疫组化检测、TMB肿瘤突变负荷分析等具有最佳的肿瘤免疫治疗预测价值。
相信看完这些内在优势，您一定开始摩拳擦掌、跃跃欲试了，那么确定选择mIHC后，接下来您想利用mIHC开展课题，需要考虑或注意哪些问题呢？让我们来接着往下看......
首先，要明确自己的研究目的
新的科研项目的启动一般是针对目前尚未解决的研究难点或新思路的验证，首先要确定想达到的目的是什么，比如用药前后肿瘤部位免疫细胞浸润和状态，免疫治疗响应者或无响应者肿瘤微环境差异，不同组织区域信号表达差异，疾病进展中肿瘤免疫细胞发展、变化等等。不同研究目的所需样本可能存在差异，接下来就要确认mIHC的样本类型及要求：
适用的主要样本类型
该技术主要用于小鼠/人源组织石蜡切片、冰冻切片以及TMA组织切片的多重免疫荧光染色，既可以是肿瘤组织也可以为正常组织。
样本处理的具体要求
① 福尔马林固定的蜡块或玻片，大块组织或TMA，封蜡不能有明显的破损。
② 玻片样本，组织需要贴近玻片，避免褶皱，玻片不能有破损、划伤或污渍。
③ 组织最小应包含大于1000个细胞。
④ 蜡块需包埋实体瘤组织，坏死瘤组织、细针穿刺物、细胞甩片样品会影响染色效果。
⑤ 组织应当用10%中性福尔马林固定，正常固定时间为18~24小时。
⑥ 切片厚度为4μm左右，使用防脱玻片。建议拨片在固定后一周内制备为佳。
⑦ 不要在水浴捞片环节添加任何粘合剂，样本应置于玻片正面、中央。将捞片竖直置于吸水纸上去除水分，轻敲去除水滴。
⑧ 切片后玻片置于40℃干燥箱上放置30min，确保水分去除、贴片牢固。
预实验样本和阳性样本的准备
① 每轮正式实验开始前，都要经过单标、多标预实验的摸索，以确保最佳染色体系以及染色效果的呈现。因此，除检测样本外，还需要准备足够的预实验样本，如果检测样本比较珍贵、稀缺，可以提供相同来源的样本，最好癌种一致。
② 另外，无论是手工还是全自动染色，任何不当的操作均会影响染色结果，因此设置阳性对照至关重要。根据对照结果来判断免疫组化操作是否规范、试剂质量是否可靠。选择阳性对照时应注意，抗体panel中所有指标均需呈阳性表达，可以选择扁桃体或阑尾等常用对照组织。
研究目的和样本确认之后，最重要的环节来了，mIHC可以实现最多8个抗体同时标记，那么选择哪几个指标就变得尤为关键。
标志物选择& panel构建
这就涉及到上面的两个主要问题—研究目的和样本类型，这决定了你抗体选择的方向。是想系统性研究多种细胞的相关性？还是只关注某一类细胞，再进行信息深挖？比如，在一篇关于乳腺癌B淋巴细胞浸润的研究中，为分析浸润的B细胞与其它免疫细胞的相互作用，选取了CD4（辅助T细胞）、CD8（细胞毒性T细胞）、CD20（B细胞）、CD68（巨噬细胞）以及panCK（肿瘤细胞）几个标志物。当然某些细胞型的确定可能不止一个标志物，比如在上期分享T细胞与疾病预后相关性的文章中，就选取了CD4、PU.1和IL-9来确定Th9亚群，CD4、STAT3和IL-17确定Th17亚群。
当然，除了基本的分型标志物外，还可以根据研究目的，加入一些免疫检查点、细胞基质等相关标志物。需要注意的是，在不同发育阶段或不同组织中某些信号的表达可能存在差异，因此也要注意相应样本类型的选择。总之，需要根据自己的研究经验或者查阅权威文献报道来选择或确定想要的指标。
选择好研究指标后，接下来就是准备一抗抗体了，那么又该注意什么呢？
一抗抗体准备
① 虽然一抗的选择已不受种属来源的限制，但目前我们的二抗试剂还只适用于鼠兔来源的一抗抗体，如果您现有一抗为其它种属来源，还需要提供相应抗一抗的HRP标记的二抗哦！
② 自行购买抗体时可以根据以往实验经验，选择抗体质量稳定、靠谱的供应商，将更有利于预实验的顺利完成。
③ 我们有健全且稳定的抗体购买流程，优质的抗体供货商，对于没有时间或渠道购买抗体的老师们，衡道也很愿意代劳。
万事俱备，只欠东风
当您准备好样本和抗体后，剩下的事就交给我们啦！最后您将拿到精美的多色荧光图像，单标类组化图像以及不同组织细胞分型、数据统计信息，开启您的科研探索之旅！
衡道病理与Akoya Biosciences 联合推出肿瘤免疫微环境检测创新技术平台，共同为转化医学、医药研发和生物学研究赋能。技术垂询：张老师，187-1772-2334。（微信ID：Calla_zky）
参考文献：
1. Garaud S, et al. Tumor infiltrating B-cells signal functional humoral immune responses in breast cancer. JCI Insight, 2019.
2. Salazar Y, et al. Microenvironmental Th9 and Th17 lymphocytes induce metastatic spreading in lung cancer. J Clin Invest, 2020.
3. Lu S, et al. Comparison of Biomarker Modalities for Predicting Response to PD-1/PD-L1 Checkpoint Blockade: A Systematic Review and Meta-analysis. JAMA Oncol, 2019.
4. 钱帮国, 焦磊. 多标记免疫荧光染色及多光谱成像技术在组织学研究中的应用[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志, 2017.