一作解读 | 农杆菌介导的高效小麦基因编辑及其在后代中的遗传规律分析

CRISPR/Cas9基因编辑技术近年来已经在农业领域展现出巨大的应用潜力，但是在小麦上进展相对缓慢。小麦基因组非常的庞大和复杂，每套基因组均相当于一个二倍体植物的基因组，而且小麦基因编辑系统与水稻、玉米相比，存在基因编辑效率较低、嵌合体比例高等问题，因此小麦的突变检测和编辑结果分析更具挑战性。虽然已经有研究表明，小麦基因编辑的目标突变可以稳定的传递给下一代，但是基因编辑突变体在后代中的遗传方式、编辑类型和变化规律研究尚未完全阐明。由于小麦具有ABD三组基因组，需要将三组基因组上的目的基因全部敲除才可能获得明显性状。然而由于T0代纯合突变的几率非常较低、嵌合体比例高，挑选单克隆测序很难覆盖所有的突变类型，因此如何快速有效地进行小麦基因编辑突变体检测、哪个世代才适合进行突变体表型鉴定等已经成为小麦基因编辑研究领域的共性问题。山东省农业科学院作物所小麦分子育种团队利用农杆菌介导的小麦遗传转化系统，选择拷贝数不同的五个基因，对其基因的编辑效率、编辑系统在各个世代的表现方式、基因编辑突变体的遗传规律等进行了系统研究，用翔实的实验数据回答了上述问题。

实验选择单拷贝的TaPinb基因（D），两个拷贝的TaDA1基因（A和B），和三个拷贝的TaDA2、TaNCED1和TaLPR2基因（ABD）等五个代表性的基因进行编辑。T0代转基因植株的检测表明，获得的突变体包含单拷贝、双拷贝以及三拷贝的突变，但是多数突变为野生型与突变型共存的嵌合体，很少有纯合突变体出现，因此T0代不适合做突变体的表型分析。进一步对突变体的后代分析表明，这些突变在小麦中可以稳定遗传，Cas9/sgRNA的持续存在可以在后代中继续产生新的突变，并且基因编辑效率比上一代明显提高，TaPinb基因在T0代没有发生突变的植株，但是在T1和T2代也检测到了突变。在统计的所有突变体材料中，T1代100%编辑的株系比例为31.3%，T2代达到66.9%。因此，经过一代或者两代自交，T1或T2代可以获得不同组合的纯合突变体，而且出现无T-DNA表达盒的纯合突变，说明农杆菌介导的基因编辑后代很容易实现T-DNA表达盒的去除，T1或T2代可以进行突变体的表型鉴定。

图1 小麦突变体的创制和检测流程

这五个基因的突变类型主要是插入和缺失，其中1bp的插入和1bp的缺失比例最高，另外还有不同长度的缺失，最长的缺失达到90bp。另外，通过检测与靶序列高度同源的序列，均未检测到突变，这说明CRISPR/Cas9系统在小麦中有很高的特异性。经过检测发现该系统具有多代持续编辑活性，可以利用常规杂交和分子标记辅助选择将编辑表达盒转移到需要打靶的更多小麦品系中，让打靶系统在新的遗传背景中发挥作用，实现小麦基因资源的快速改良。

该研究由山东省农业科学院作物研究所李根英博士领衔的小麦分子育种团队完成，该研究结果于2019年8月30日在线发表于International Journal of Molecular Sciences (doi:10.3390/ijms20174257)杂志。该团队的张淑娟和张荣志博士为共同第一作者，李根英和李玉莲博士为共同通讯作者。