ELISA实验样本处理方法

可用于ELISA实验的样本一般有血清、血浆、尿液、细胞培养上清以及组织匀浆等。不同样本类型的预处理方法也不同。适当的样本预处理是确保ELISA实验正确性和准确性的第一步。这里，我们将介绍几种不同样本类型的处理方法。

1.   血清

血清是ELISA实验最常用的样本，其预处理也十分简单。

使用无热原无内毒素的试管或离心管采集血液样本，将试管或离心管在室温下放置2小时或4℃过夜，分离出血清（建议倾斜试管或离心管以扩大液面的横截面，使血清可以更大程度地分离出来）。4℃下以1000×g离心20分钟，小心收集上清液（血清），立即进行测定。建议在-20℃或-80℃下将收集的血清分装保存，避免反复冻融。

在收集血液样本的过程中应避免溶血，因为红细胞在溶解时会释放具有过氧化物酶活性的物质，这种情况下，ELISA实验中将会出现非特异性显色反应，导致检测结果不准确，出现假阳性结果。另外，样本还应避免细菌污染，因为细菌可能含有内源性HRP，也会导致检测结果不准确。

2.   血浆

使用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液样本，采集后30分钟内，4℃下以1000×g离心15分钟，小心收集上清液（血浆）。建议在-20℃或-80℃下将收集的血浆分装保存，避免反复冻融。样本应避免溶血或高血脂。常见的抗凝剂包括EDTA，肝素钠，枸橼酸钠等。检测前请仔细阅读ELISA试剂盒说明书，查看该试剂盒针对抗凝剂是否有特殊要求。

3.   细胞培养上清

将细胞培养上清液吸入离心管中并以1000×g离心20分钟，除去细胞碎片和杂质，收集上清液备用，样本保存在-20℃或-80℃，避免反复冻融。

4.   细胞

反复冻融方法：

(1)    吸出培养板中的培养基，用胰蛋白酶消化细胞，然后加入适量的培养基将培养板上的细胞冲洗干净。悬浮细胞可以省略该步骤。

(2)    将细胞悬浮液收集到离心管中，以1000×g离心10分钟，然后吸去培养基，用预冷PBS洗涤细胞3次。

(3)    加入适量的预冷PBS（建议在使用前立即加入蛋白酶抑制剂）重悬细胞。在6孔培养板中，每个孔需要150-250μL的PBS来重悬细胞。

(4)    使样本在-20℃或-80℃条件和室温条件下反复冻融，重复冻融过程数次，直至细胞完全裂解。也可以使用超声波细胞破碎器超声处理悬浮液来裂解细胞。

(5)    4℃下以10,000×g离心10分钟，去除细胞碎片，收集上清液， -20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

5.   组织匀浆

(1)    用预冷的PBS（0.01M，PH7.4）冲洗组织以除去表面残留的血液或杂质。

(2)    将组织块称重，然后切成尽可能小的碎块，以便充分匀浆。

(3)    加入适量的预冷PBS（体积取决于组织的重量，9 mL PBS适用于1 g组织，建议使用前立即在PBS中加入适量蛋白酶抑制剂），用玻璃匀浆器在冰上或冰浴中充分匀浆。

(4)    将匀浆液吸入离心管中，4℃ 下以5000×g离心5~10分钟，收集上清液，保存至-20℃或-80℃，避免反复冻融。

6.   尿液、唾液及其他生物体液

以1000×g离心20分钟，收集上清液，立即进行测定。

一般来说，由于ELISA实验只能检测可溶性蛋白质的含量，因此要求样本应清晰透明并离心除去沉淀物或悬浮物质。为确保实验的准确性， -20℃或-80℃保存的样本应在1-6个月内完成检测，4℃保存的样本在一周内完成检测。此外，样本中不能含有会抑制HRP活性的NaN3，否则会造成假阴性结果。