单细胞测序文献精读|乳腺肿瘤微环境中不同免疫表型的单细胞图谱
Title：Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment
F1AB，S1A：为了生成人类乳腺癌中免疫细胞状态的深层转录图，我们构建了一个图集，其中包含47016个CD45 +细胞，这些细胞是从8种原发性乳腺癌患者中收集的，这些细胞来自未经治疗的患者，包括雌激素受体（ER +）和孕激素受体（PR +）阳性，人类表皮生长因子受体2扩增（Her2 +）和三阴性（TNBC）癌症。为了评估跨乳腺癌亚型的肿瘤微环境对免疫细胞表型的共同影响，我们还分析了来自新鲜手术标本的匹配正常乳腺组织，外周血和淋巴结的CD45 +细胞。相应的荧光激活细胞分选（FACS）纯化的CD45+细胞群进行使用inDrop平台单细胞RNA测序（scRNA-SEQ）
S1B，S8：我们开发了SEQC流水线，用于处理数据，从而提高了所得单细胞谱的敏感性和选择性，为了消除技术影响并保留复杂的生物变异，我们使用了Biscuit的缩放版本和改进版本对合并的数据进行聚类.Biscuit是一种贝叶斯分层模型，可以在同时归一化和估算的情况下推断聚类，从而使我们能够校正细胞内和批次内在变异。
F1C，S1C：我们首先使用PhenoGraph聚类验证了每位患者的主要免疫细胞类型是可识别的，我们使用簇平均表达与先前表征的免疫细胞亚群的转录特征，及其规范标记之间的全基因组关联为簇注释。我们能够鉴定出大多数预期的免疫细胞类型，包括单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞（DC），T细胞，B细胞，肥大细胞和嗜中性粒细胞
F1D：我们发现每种肿瘤的免疫组成存在很大程度的差异，例如，髓样和T细胞级分分别占4％-55％和21％-96％。
F1E：我们还观察到了患者之间代谢特征的变化，包括缺氧。
S1E-G：尽管所有患者在缺氧签名中均表达了相似的平均基因程度，但表达在签名中单个基因的水平上有所不同。在脂肪酸代谢，糖酵解和磷酸化中观察到类似的变化。
F2A：同一患者的细胞通常比同一患者的相同谱系的细胞更相似，这可能是由于批次效应和将生物学信号和技术差异混为一谈的标准归一化程序所致。我们还观察到了从活化细胞捕获的分子数量的增加，这可能是由于活化后总RNA丰度的增加所致。
F2B：肿瘤中CD8 T细胞的活化梯度最为明显，在TNBC肿瘤（BC3）中最为明显。
F2C：将Biscuit应用于所有肿瘤的数据后，我们发现T细胞，巨噬细胞，单核细胞，B细胞和自然杀伤（NK）细胞簇。
F2AD：我们使用基于熵的量度来量化样本混合，虽然使用标准归一化方法在单个样本中的细胞最相似，但是在Biscuit归一化之后对此进行了校正，从而显着改善了患者之间的细胞混合。
F2AC：使用这种方法，我们成功地保留了有关免疫细胞激活的信息，同时稳定了文库大小的差异，并在估算数据中发现了丰富而强大的结构，这表明免疫细胞亚型的多样性。F2EF，S2AB：我们合并了所有组织和患者的数据，揭示了83个簇的不同集合。为了将每个簇分配给一个细胞类型，我们将簇的平均表达与排序后的大量数据集进行了比较。
S2C：大量的聚类促使我们使用交叉验证测试其强大性，显示了强大的聚类分配。
F2G：大多数集群在多个患者之间共享，只有10个是针对患者的。S2D：我们使用熵来量化患者的特异性，发现簇在患者混合程度方面差异很大
S2：确定了38个T细胞，27个髓系谱系，9个B细胞和9个NK细胞簇。F2H：这些注释已使用规范标记的表达进行了确认和修饰。
F2IJ：在T细胞簇中，我们鉴定出15个CD8 +和21个CD4 +簇，它们被分为9个天真，7个中央记忆，15个效应子记忆和5个Treg簇。骨髓簇分为3个巨噬细胞，3个肥大细胞，4个嗜中性粒细胞，3个树突细胞，1个浆细胞样树突细胞和13个单核细胞簇。最后，我们确定了3个CD56 – NK细胞簇和6个CD56 +NK细胞簇，其中2个可能是NKT细胞。
F2FH：宽细胞类型（例如15个效应记忆T细胞簇）由一小组表面标记定义。
S23：为了进一步区分这些簇，我们使用了它们的全基因组图谱。饼干基于均值表达和协方差模式（即基因的共表达）识别簇。这些参数有助于鉴定差异表达的基因，这些基因表征了主要细胞类型内的多个亚群。S2EF：我们通过测量成对聚类相似性（有无均值表达的影响）观察到协方差在定义T细胞聚类中的显着效果。即使平均基因表达均衡后，大多数簇之间仍存在较大差异。
F3AB：为了量化免疫表型变异受其居住组织驱动的程度，我们使用t分布随机邻居嵌入（t-SNE）进行可视化组织之间的重叠，表明血液和淋巴结中的T细胞与乳腺组织中的T细胞相比表现出不同的表型。尽管T和髓系谱系细胞在肿瘤和正常组织样本之间表现出相当大的重叠，但我们观察到表型异质性增加，肿瘤中细胞群扩大。
F3C：幼稚T细胞在3个血液特异性簇中高度富集（χ2，p = 3×10 -80），而B细胞在淋巴结中的流行程度高于其他组织（χ2，p = 0.0）。肿瘤和正常组织中均存在一部分T细胞簇，但肿瘤中的细胞毒性T细胞簇更为丰富（χ2，p = 3×10 -25），Treg簇也是如此（p = 5×10 -91）。此外，正常和肿瘤组织之间共享一些髓样簇，而更多活化的巨噬细胞簇则对肿瘤具有特异性（肿瘤相关巨噬细胞或TAM）（χ2，p = 0.0）。这些发现表明，驻留组织是免疫表型的重要决定因素，基于血液免疫细胞的生物标志物不一定反映肿瘤中免疫细胞的组成。
F3D：与正常组织相比，肿瘤中基因表达差异的显着增加驱动了细胞状态多样性的提高。
F3E，S3AB，S5：我们发现方差增加最大的基因丰富了在肿瘤环境中激活的信号通路，包括I型（IFNα）和II型干扰素（IFNγ），肿瘤坏死因子α（TNF-α），转化生长因子β（ TGF-β），IL-6 / JAK / STAT信号和缺氧。
F3F：为了进一步探讨这种方差的增加，我们为细胞所占据的“表型体积”定义了一个度量。具体而言，此度量标准使用基因表达的协方差来衡量独立表型所跨越的体积，使用该度量，我们比较了正常组织与肿瘤组织中每种细胞类型所占据的表型体积。体积变化的评估显示，与正常乳腺组织相比，肿瘤中所有主要细胞类型（包括T细胞，髓样细胞和NK细胞）的表型体积显着增加（U检验，p = 0）。准确地说，T细胞的体积倍数变化为7.39×10 4，髓样细胞的体积倍数变化为1.18×10 14，而6.08×10NK细胞中的表型为4，表明与正常组织相比，肿瘤的表型体积大量增加。
S1D：我们使用扩散图来表征观察到的表型变异的最重要来源。对T细胞和髓样细胞分别进行此分析，以避免细胞类型特异性捕获率产生偏差。
F4A，S4A：尽管某些T细胞成分区分了离散簇，但大多数成分定义了变化的逐渐趋势。
F4B-D，S4B-F：前3个最有用的成分分别与激活，终末分化和缺氧的特征相关。标记为“激活”的变异中最有用的成分与T细胞活化和进行性分化的基因特征以及IFNγ信号高度相关（p = 0.0）。激活标记的平均表达沿组件稳定增加，同时特定激活相关基因的表达也随之逐渐增加。肿瘤内T细胞群（包括Treg和效应记忆T细胞）在该成分的激活末端富集（t检验，p = 0.0；而幼稚的外周血T细胞聚集在激活最少的末端，与其静止状态一致（t检验p = 0.0；尽管簇的平均表达水平沿组件逐渐变化，但是每个簇内都有广泛的激活状态，已知与该成分最相关的基因在激活和进行性分化时会增加，包括溶细胞效应分子A 和K 颗粒酶（GZMA和GZMK），促炎性细胞因子（白介素32 [IL-32]），细胞因子受体亚基（IL2RB） ），趋化因子（CCL4，CCL5）及其受体（CXCR4，CCR5）。
F4E：变异的下一个信息量最大的成分称为“末端分化”。
S4B：与它最相关的基因包括共刺激分子（CD2，GITR，OX40和4-1BB）以及共抑制受体（CTLA-4和TIGIT）。
F4AC，S4B：该组还包括FOXP3，IL2RA和ENTPD1（CD39），这是Treg细胞的特征基因，与激活和末端分化成分最相关的基因存在中等程度的重叠。F4F：也存在重要的差异，包括上面列出的耗尽标记，并且簇的顺序沿这两个分量不同。
S4B-D：某些簇，尤其是淋巴结T细胞（例如簇16），表达的活化水平高于终末分化（t检验，p = 0.0；与T细胞衰竭/终末分化显着一致在非淋巴组织中。
F4A，S4D：可视化的T细胞活化和终末分化成分一起显示了显着的连续性，本质上代表了一条连续的轨迹。
F5A：CD4效应子和中央记忆簇表现出参与I型和II型干扰素反应（F检验，分别为p = 1×10 -54和0.008），缺氧（F -test，p = 4×10 -64），和无反应性（F检验，p = 4×10 -69）。
F5B：CD8效应子和中央记忆簇在激活（F检验，p = 2×10 -114），促炎（F检验，p = 1×10 -39）和细胞溶解表达水平上也不同。与效应子途径相关的基因（F检验，p = 6×10 -32）。
F5C：与效应T细胞相反，大多数Treg簇的抗炎，疲惫，缺氧和代谢基因集具有相似的模式。
F5D：2个标记基因可以在2个不同的簇中表现出相似的平均表达（例如，在两个簇中都高度表达），而这些簇在这些基因之间的协方差中显示出相反的符号。发生这种情况是由于这些基因通常在一个簇中的同一细胞中共表达（即正协方差），但在另一簇中以互斥的方式表达（即负协方差）
F5E-G，S5AB：原型共抑制基因CTLA-4与其他机械相关基因表现出丰富的协方差模式。
F5FG：在Treg簇46、56和87中，CTLA-4与TIGIT和共刺激受体GITR 强烈共变；与CD27在簇46和80; 并且仅在簇80中具有共刺激受体ICOS，跨Treg簇，检查点受体之间的协方差模式通常会有所不同F5H：其他重要的免疫基因表现出模块化的协方差结构，表明存在共同调节作用，并可能参与类似的功能模式
F5I：由于在单个患者样本中观察到不同比例的Treg簇，因此在患者水平上也存在基因共表达的差异，并且大多数患者没有Treg细胞的所有5种亚型
S5C：2个Treg簇在协方差和差异表达基因方面类似于簇82和46
S5D：我们还观察到了激活的T细胞簇之间共变模式的差异
F5GH：基因的共变异在定义T细胞簇，特别是Treg簇中起作用。F6AB，S6：在使用10x平台生成的合并数据集上使用Biscuit识别的T细胞簇对从inDrop数据集推断出的T细胞簇表现出接近一对一的映射关系，克隆型20存在于无反应性和糖异生的高簇中。
S6C：该分析还沿T细胞激活轨迹再现了一个连续的梯度。F6C，S6D：为了评估TCR多样性解释这种连续性的程度，我们分别使用以下方法映射了每种克隆型的激活状态配对数据。这表明克隆型的一个子集表现出不同的平均激活水平。
F6C，S6E：在每种单独的克隆型中都存在令人惊讶的广泛激活状态。F5AB，S2B：虽然我们观察到解释免疫细胞间变异（例如激活）的主要成分表现出连续性，但T细胞簇可根据其与环境刺激反应相关的特征信号的差异表达来分离。F6D：对于使用10x技术分析的肿瘤驻留T细胞，观察到了类似的趋势。
F6E：当与TCR克隆型共同分析时，我们观察到每个簇实际上都由克隆型的不同组合子集组成，在某些情况下，具有克隆型的集群表现出相似的激活水平。
F6F，S6F：每种克隆型仅存在于少数相关簇中，这些簇在表型上比随机选择的簇显着相似，因此在t-SNE投影中占据了一个受限区域。
F6DE：而在其他情况下，此类集群在与环境刺激有关的特征上相似。例如在肿瘤BC9中，克隆型9存在于簇T11和T12中，它们在几乎所有环境特征中的表达水平都非常相似F7A：对BC1-8中发现的单核细胞簇的广泛调查表明，在这些主要细胞类型中存在未探索的亚结构。
F7B：与T细胞一样，我们使用扩散图来评估这种异质性，不包括嗜中性粒细胞和肥大细胞，因为它们形成了更多不同的簇。
S7A：该分析揭示了四个主要分支，它们比T细胞显示出更多不同的细胞状态F7B-F：第一分支几乎全部包含来自3个簇（23、25和28）的肿瘤内巨噬细胞（TAM）
F7B-D，S7B-D：接下来的两个组成部分捕获了从血液单核细胞到肿瘤内单核细胞的逐渐变化的轨迹
F7BE，S7BCE：具有2个离散状态的附加组件将浆细胞样DC（pDC）与其他单核细胞簇区分开。
S7B：专注于第一分支，最相关的基因包括APOE，CD68，TREM2和CHIT1，这可能反映了募集的或组织驻留的巨噬细胞的分化和激活。此外，与“交替激活的”（M2）巨噬细胞相关的基因表达，包括清道夫受体 MARCO，促血管生成受体NRP2和抑制性分子B7-H3（CD276）沿该分支增加S7E：与“经典激活”（M1）巨噬细胞相关的免疫刺激基因，包括趋化因子CCL3（MIP-1a），沿着分支增加。TAM的所有3个种群，特别是第23和28簇，都属于典型M2签名最高表达的单核细胞簇，但在M1签名中同样很高F7G：我们发现髓样群体中的M1和M2基因签名呈正相关，与其他肿瘤类型的最新发现一致，肿瘤微环境中的巨噬细胞活化与离散模型不符，无论是离散状态还是沿着替代极化轨迹的光谱。
F7H-J，S7FG：2种M2型标记物MARCO和B7-H3的共表达。尽管TAM簇均表达高水平的两种基因，但它们在簇23和25中呈正相关，而在簇28中呈负相关。在原始未归一化数据中，不同的协方差模式也很重要