【Protocol】巨噬细胞M1、M2极化的Protocol你还在苦寻吗？这里有
巨噬细胞是机体内非常重要的一类免疫细胞，也是当下科研工作者们的研究热点。在之前的文章中我们也对巨噬细胞做过简单的介绍，但鉴于大家对巨噬细胞的极化以及极化后如何用流式来进行鉴定存在很多疑虑，那今天的这篇文章我们做了个简单的归纳和总结，希望能对大家有所帮助。
关于巨噬细胞分型的问题，其实随着研究的深入，不断会有新的类型被大家定义出来。但是最为大家所熟知，也是大家研究最多的巨噬细胞的极化包括两个极端，即经典活化的巨噬细胞（也就是M1型巨噬细胞），和替代性活化巨噬细胞（也就是M2型巨噬细胞）。
图自：Oncotarget. 2018 Apr 03 |
https://doi.org/10.18632/Oncotarget.24788
M1型巨噬细胞
诱导因子：IFN-γ、LPS、GM-CSF等；
功能：
1. 高表达促炎因子，介导促炎反应；
2. 机体受到感染时发生抗菌作用；
3. 抑制肿瘤的形成；
4. 介导Th1型免疫反应
5. ……
M2型巨噬细胞
诱导因子：IL-4、IL-13、IL-10、M-CSF、TGF-β等；
功能：
1. 高表达抑炎因子，介导抑炎反应；
2. 参与组织重建；
3. 促进肿瘤的形成；
4. 介导Th2型免疫应答；
5. ……
人外周血向巨噬细胞的极化
实验方案：
1. 从外周血中分离PBMCs，可使用人淋巴细胞分离液进行此步；
2. 从PBMCs中分离单核细胞，可使用CD14单核细胞磁珠分选试剂盒进行此步；
3. 调整单核细胞浓度为1-2×10^6/ml（可参考文献），在完全培养基中添加M-CSF（25ng/ml）诱导单核细胞向巨噬细胞的成熟；
4. 5天左右分化成熟为巨噬细胞（贴壁），可选择CD68 表达作为鉴定巨噬细胞成熟的标志蛋白；
5. 将成熟的巨噬细胞消化下来，重新铺板，诱导向M1、M2的极化：
M1极化因子：LPS（50ng/ml） IFN-γ（20ng/ml）
M2极化因子：IL-4（20ng/ml） IL-10（20ng/ml）
6. 以上两种极化方式刺激因子的浓度参考自以下文献。刺激24小时后，用流式的方法检测极化后M1、M2标志蛋白的表达。M1巨噬细胞上调表达CD86、MHCⅡ、CD80、CD274等，M2巨噬细胞上调表达CD206、CD163等；
实验结果举例：
图：流式检测PBMCs向M1、M2巨噬细胞极化后结果图
参考文献：
1. Immunobiology. 2014 Sep | https://doi.org/10.1016/j.imbio.2014.05.002
2. Scand.J.Immunol 2014 May | https://doi.org/10.1111/sji.12162
小鼠骨髓向巨噬细胞的极化
实验方案：
1. 6-8周龄小鼠取股骨和胫骨骨髓，裂红后制备为单细胞悬液；
2. 调整细胞浓度为2×10^6/ml（可参考文献），铺板培养，在完全培养基中添加10ng/ml M-CSF（或L-929细胞上清）诱导向巨噬细胞的成熟；
3. 5-7天左右分化成熟为巨噬细胞（贴壁），中途可在3天进行培养基更换（或半量换液），可选择F4/80 CD11b 双阳表达作为鉴定巨噬细胞成熟的标志蛋白；
4. 将成熟的巨噬细胞消化下来，重新铺板，诱导向M1、M2的极化：
M1极化因子：LPS（100ng/ml） IFN-γ（50ng/ml）
M2极化因子：IL-4（10ng/ml） IL-10（或IL-13）（10ng/ml）
5. 以上两种极化方式刺激因子的浓度参考自以下文献。刺激24小时后，用流式的方法检测极化后M1、M2标志蛋白的表达。M1巨噬细胞上调表达CD86、MHCⅡ、CD11c等，M2巨噬细胞上调表达CD206等；
实验结果举例：
参考文献：
1. JoVE. June 2013 | https://doi.org/10.3791/50323
2. Sci Rep. 2020 | https://doi.org/10.1038/s41598-020-57677-5
THP-1细胞向M1，M2的极化
实验方案：
1. 每孔铺8×10^5个细胞至6孔板中，在THP-1完全培养基中添加PMA（100ng/ml）诱导其向巨噬细胞的成熟；
2. 48小时后THP-1细胞成熟为巨噬细胞，从悬浮状态变为贴壁细胞。可选择CD11b 表达作为鉴定巨噬细胞成熟的标志蛋白；
3. 将成熟的巨噬细胞消化下来，重新铺板，诱导向M1、M2的极化：
M1极化因子：LPS（100ng/ml） IFN-γ（20ng/ml）
M2极化因子：IL-4（20ng/ml） IL-13（20ng/ml）
4. 以上两种极化方式刺激因子的浓度参考自以下文献。刺激48小时后，用流式的方法检测极化后M1、M2标志蛋白的表达。M1巨噬细胞上调表达CD86等，M2巨噬细胞上调表达CD206等；
参考文献：
1. Cell&Bioscience. 2020 | https://doi.org/10.1186/s13578-020-00450-y
2. BMC Cancer. 2015 | https://doi.org/10.1186/s12885-015-1546-9
RAW264.7向M1，M2的极化
相较于THP-1细胞来说，RAW264.7的极化相对来说更简单，可直接添加刺激物向两个不同的方向诱导。
实验方案：
1. 添加刺激物诱导RAW264.7向M1、M2的极化：
M1极化因子：LPS（100ng/ml）
M2极化因子：IL-4（20ng/ml）（可添加20ng/ml IL-10）
2. 以上两种极化方式刺激因子的浓度参考自以下文献。刺激24或48小时后，用流式的方法检测极化后M1、M2标志蛋白的表达。M1巨噬细胞上调表达CD86等，M2巨噬细胞上调表达CD206等；
参考文献：
1. J Cell Biochem. 2018 Mar | https://doi.org/10.1002/jcb.26509
2. J Mol Cell Cardiol. 2018 Jun r | https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2018.04.011
Tips
1. 单核细胞、巨噬细胞表面高表达FcR，流式染色前建议进行FcR的封闭，以尽可能降低抗体的非特异性结合；
2. 人CD68（克隆号：Y1/82A）、小鼠CD68（克隆号：FA-11）、小鼠CD206（克隆号：C068C2），以上指标为跨膜抗原，对应克隆号抗体流式染色时需要做固定破膜胞内染色；
3. 以上所有Protocol均参考自文献，刺激浓度及时间如果出入，大家可参考权威杂志，也欢迎大家交流指正。
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