【LorMe周刊】体内显微技术揭示微生物互作对菌群定殖的影响

作者：邵正英，南京农业大学博士在读，主要研究铁载体介导的根际细菌互作。

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍利用体内显微镜技术揭示铜绿假单胞菌互作对其在寄主体内定殖的影响。原文2019年发表在The ISME Journal。

导读

致病细菌通过参与微生物互作，如群感效应和分泌作为公共物质的毒力因子，在宿主内定殖。也有研究证明合作的个体会突变成欺骗者参与互作。本文开发了一种实时成像系统，实时检测毒力因子的表达和观察铜绿假单胞菌在线虫体内的互作，以期揭示微生物互作对其在寄主体内定殖的影响。本文发现在感染过程中共享铁载体表达和群感效应系统发生有益于非生产者（欺骗者）定殖，但在数量上非生产者并不能超越生产者。结果表明，欺骗者有限的定殖是毒力因子下调所致，毒力因子有助于菌株定殖但并不是必须的。本文结果表明利用细菌在感染中的微生物互作为治疗方案存在潜在局限性。

图示线虫肠道mCherry荧光标记细菌（左）以及肠道内所有荧光标记细菌（右）定殖情况

主要结果

本文以线虫为宿主，铜绿假单胞菌PAO1为病原菌。线虫可食细菌，大部分细菌在采食过程中被杀死，但仍有少部分被存活，如病原铜绿假单胞菌，它可释放铁载体摄取宿主的铁。在高密度时，在群感效应控制下释放毒力因子攻击寄主组织。因此作者利用群感效应和铁载体两种特性作为研究感染互作的特征。

一、PAO1在线虫肠道中的动态定殖

初期，线虫可摄取大量细菌进入肠道，但6 h后减少了许多24 h后没有显著变化.说明经过一段时间大部分细菌被线虫消化，但是仍有部分细菌在线虫肠道成功定殖。

图1  野生型PAO1-mCherry菌株的动态定殖情况

线虫在含细菌缓冲液中放置0h并移除后，线虫肠道内含有较高的细菌。当线虫在缓冲液中保存6小时后，肠道内细菌数量先下降，随后24小时保持不变。

二、PVD以及群感效应表达有助于细菌定殖

部分细菌在线虫肠道内成功定殖，并且显著表达铁载体PVD以及群感效应相关的两个基因，说明PVD以及群感效应与细菌的定殖十分相关。

图2  铜绿假单胞菌在寄主肠道内铁载体合成基因和群感效应调节子基因表达情况

为了定量检测寄主体内毒力因子基因的表达，将线虫培养于4株标记过后的PAO1中，每株分别标记铁载体PVD启动子基因（pvdA）、铁载体PVC的启动基因（pchEF）、群感效应调节子基因lasR或rhlR。除了pchEF，其他的基因都在寄主内显著表达，且定殖30h后，也有显著在寄主内表达。

三、菌株社会特征之间具有调节联系

研究表明PVD的合成会抑制PVC的合成，但PVC在PVD不足时，具有补偿性作用（图3A, B）；而LAS群感系统也可正向激活Rhl群感系统(图3C, D)。作者进一步验证这些联系在寄主内部发生情况。验证发现只有在两种铁载体都缺失才会影响定殖，而对于QS调节因子来讲，只有LAS系统缺失会导致定殖效果下降。因此选定双铁载体缺陷株PAO1△pvdDpchEF以及LAS系统缺失PAO1△lasR为欺骗者。

图3  铜绿假单胞菌可以在两种铁载体之间进行切换产生，而两种群感效应调节子的作用具有先后顺序

A: PVD合成基因(pvdA)在野生型中显著表达，而PVC合成缺陷株△pchEF的表达下调；B: PVC合成基因pchEF在PVD合成缺陷株△pvdA中显著表达，而在野生型中无表达；C: 与野生型相比，QS调节基因LasR在Rhl缺陷株△rhlR中表达无差异；D: QS调节基因rhlR的在LasR表达缺陷株△lasR中表达降低。

四、混合群落可在宿主内部形成，但剥削行为受限

结果发现在欺骗者与野生型形成的混合群落中，欺骗者没有显著生长优势（图4A），说明欺骗者可从中受益但无法超越生产者。并且发现野生型与寄主肠道总的菌群数量只在定殖前期呈正相关(图4B)。说明当生产者（野生型）数量在较少时可因生产功能在前期具有生长优势。

图4  混合感染揭示了社会应变动态，但没有成功作弊

A：分别表示了野生型PAO1-mCherry在线虫肠道内与未标记的PAO1和PAO1ΔpvdDΔpchEF以及PAO1ΔlasR竞争42 h后的相对适应度；B:表示了野生型PAO1-mCherry分别与PAO1ΔpvdDΔpchEF以及PAO1ΔlasR竞争时，PAO1-mCherry种群数量与寄主肠道总的菌群数量的关系。

结论

本文开发了一个实时成像系统，使得可以原位观察、跟踪病原菌对宿主的定殖及其在宿主体内的毒力因子的表达情况。结果表明混合群落中非生产者可从生产者分泌的毒力因子中获益，但非生产者无法超过、替代生产者。其中原因有可能是非生产者是负频率选择机制，或是由于线虫肠道细菌密度过低导致共享行为的受限，或是因为文中两种特性并不是定殖所必需的因子，也可能是某种特性的缺失可能会导致其它性状的改变进而影响其适应性。

论文信息

原名：In-vivo microscopy reveals the impact of Pseudomonas aeruginosa social interactions on host colonization

译名：利用体内显微技术揭示铜绿假单胞菌互作对其在寄主体内定殖的影响

期刊：The ISME Journal (2019)

IF：9.493

发表时间：2019.5

通讯作者：Rolf Kümmerli

通讯作者单位：苏黎世大学