【LorMe周刊】基于转座子插入测序方法高通量分析噬菌体的侵染受体

作者：刘艳，南京农业大学硕士在读，主要研究利用噬菌体组合防控青枯病。

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍基于转座子插入测序方法高通量分析噬菌体的侵染受体。原文于2020年发表在PNAS上。

导读

作为地球上最丰富的微生物，噬菌体很容易从环境样品中分离出来。然而，表征噬菌体与细菌的相互作用仍然具有挑战性。本文测试了转座子插入测序（INSeq）是否可以用于鉴定参与噬菌体结合的细菌基因。结果显示INSeq筛选成功地鉴定了编码先前表征的大肠杆菌病毒（噬菌体T6、T2、T4和T7）的已知受体的基因。然后利用INSeq筛选来鉴定六种新分离的大肠杆菌噬菌体感染过程中涉及的基因。结果发现大多数噬菌体（5/6）的备选受体被成功鉴定，其中编码噬菌体侵染受体的基因的命中率最高。INSeq筛选为探究噬菌体受体提供了一种普遍有用的方法。

如何进行INSeq筛选的设计

利用高通量的方法检索那些能够在裂解性噬菌体选择过程中存活下来的细菌的基因组，鉴定可能的噬菌体受体（图1A）。在噬菌体的选择压下，与噬菌体抗性相关的基因突变会导致细菌的适应性降低，所以在输出转座子突变体库（TMP）中出现频率较低（红色）；而噬菌体感染所需的基因（如噬菌体受体）突变会增加细菌的适应性优势，所以会在输出的TMP中富集（蓝色，图1B）。‍

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图1 INSeq筛选的设计

INSeq转座子突变体库涵盖了80%的非必需基因

最终汇集的转座子突变体库由3253个细菌基因中包含17100个独立的转座子插入组成。结果如图2所示：基因组覆盖率似乎不受mariner转座子固有GC偏差的影响。然而，在大肠杆菌K-12复制起点附近，转座子的数量增加（图2）。可能是在DNA复制过程中出现了多个拷贝的起源。虽然最终文库不是完全饱和，但约80%的非必需基因至少出现一次独立的转座子插入。

图2 大肠杆菌菌株BW25113的基因组图谱：内圈表示GC含量，第二圈表示编码区（绿色）或基因间区（蓝色）中转座子插入的数量

INSeq识别T6、T2、T4和T7噬菌体的受体

测试了INSeq筛选是否能准确识别四种表征的T6、T2、T4和T7噬菌体的细菌受体。对照由“模拟感染”的INSeq筛选组成，模拟感染同样进行，但是没有这四种噬菌体。图3A-D结果表明，与模拟感染对照相比，在测试噬菌体存在的情况下，每次筛选都导致观察到的TMP转移，许多转座子突变体在输出中的代表性不足。然而，并不妨碍识别编码噬菌体受体的基因的能力，这些基因的突变体在输出中应该过多。这一结果与噬菌体对TMP施加强大的选择压力相一致。‍

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图3 利用特征明确的噬菌体进行INSeq筛选的结果

验证已知特征的噬菌体受体

进行了平板效率（EOP）分析，以测量噬菌体有效感染缺乏候选基因表达的细菌菌株的能力。由于EOP没有直接测定噬菌体附着，吸附试验被用来确认假定的基因是命中的子集的噬菌体受体（图4），发现EOP和吸附试验成功地证实了噬菌体T6、T2和T4筛选出的最大的已知的受体。此外，脂多糖吸附滴度的降低证实了噬菌体T7的GO 富集预测的功能。

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图4 验证特征明确的噬菌体受体的分析

INSeq识别新分离噬菌体的候选受体

进一步利用验证过的方法筛选新噬菌体的受体。从环境噬菌体分离物的文库中随机选择六种噬菌体（EC14、EC35、R3、P2、U115和8S），并进行INSeq筛选以鉴定受体。结果显示具有统计显著性的命中具有输出相对于输入相对丰度的正对数比率，灰色代表显著的命中，排名靠前的点击率ompA::Tn、tsx::Tn、ompC::Tn和lamB::Tn分别为绿色、蓝色、紫色和红色，并且编码膜蛋白的基因被认为需要进一步验证。

图5 编码膜蛋白的基因中106个转座子突变体相对丰度的对数比率

验证新分离的噬菌体受体

EOP和吸附试验用于验证在每个INSeq筛选中鉴定的新噬菌体的候选受体。EOP分析和吸附分析的结果图6A-B显示：OmpA是新噬菌体R3的主要受体。噬菌体U115不需要LamB作为受体来吸附或感染大肠杆菌，Tsx是噬菌体U115的主要受体（图6C-D）。图6E-F显示LamB对噬菌体8S的吸附是必需的，OmpC是辅助受体。与噬菌体8S的筛选相似，噬菌体EC35利用lamB作为主要受体，但可能需要ompC作为辅助受体（图6G-H）。图6I-J显示噬菌体EC14能够使用LamB或OmpC作为受体。筛选的噬菌体P2的外膜表达基因没有被命中，这可能是噬菌体P2利用脂多糖作为受体，或噬菌体P2有多个受体，还可能该受体不包含在转座子突变体库中等等。‍

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图6 验证新分离的噬菌体受体的分析

结论

转座子插入测序是一种强有力的技术，可以鉴定在特定选择性条件下有助于适应性的细菌基因。作者利用INSeq筛选来鉴定多株大肠杆菌噬菌体的受体，并利用试验验证相关的噬菌体受体；然后，扩展到识别六个随机选择的噬菌体的受体。除了识别噬菌体受体，筛选结果还可以提供噬菌体存在下其他细菌基因的适应性信息，例如参与噬菌体复制或噬菌体抗性的细菌基因。高通量鉴定噬菌体受体的方法能够快速鉴定新分离的靶向不同细菌的噬菌体。此外，除了允许对噬菌体受体进行高通量鉴定外，INSeq筛选还用于探究噬菌体抗性机制。

论文信息

原名：High-throughput discovery of phage receptors using transposon insertion sequencing of bacteria

译名：基于转座子插入测序方法高通量分析噬菌体的侵染受体

期刊：PNAS

IF₂₀₂₀：9.412

发表时间：2020.08

通讯作者：Paul E. Turner 

通讯作者单位：耶鲁大学医学院