Image j 灰度分析wb条带

当我们处理细胞之后，想看一下该处理对细胞中某一基因表达的影响，我们需要从蛋白水平来看一下该基因表达的蛋白的量的变化，那我们通常会做westernblot，对蛋白进行半定量，通过对westernblot结果的分析，我们可以知道该处理对基因的表达造成了什么影响。

对于一些时间点或者是不同组织蛋白表达量的分析就涉及到量的变化。当然我们通过观察处理前后条带的深浅可以大概的判断该处理对基因的表达造成了什么影响，但是这种判断是存在误差的，误差来源于我们上样的时候并不能保证每个加样孔的上样量都一样，所以我们不能只通过观察条带的深浅来判断该处理对基因的表达造成了什么影响。这时候就需要对westernblot的结果条带的灰度值进行计算并做统计分析——目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值，以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量，这样得到的结果才更加准确、更有说服力。一些成像软件带有此分析工具，比如QuantityOne，Bandscan，Gel-ProAnalyzer，TanonImage软件等成像系统专用软件。除了这些软件，还有一个比较简单的综合性质图像处理软件ImageJ可以很方便的进行灰度分析，而且ImageJ是免费软件，可以在其官网直接下载使用。利用ImageJ软件进行WB条带灰度分析时存在两种方法，此处只列举一种方法，具体步骤如下：

1、打开Image J软件。

2、导入WB条带图片：File→Open→找到WB条带。

3、把图片转化成灰度图片：Image→Type→8-bit。

4、消除图片背景的影响：Process→Subtract Background，在弹出的对话框中，填上50基本就可以了，并勾上Lightbackground，点击OK。此时图片背景会变白一些。

5、设置定量参数：Analyze→Set Measurements。在弹出的对话框中勾选Area、Mean grayvalue、Min& max gray value、Integrated density。

6、设置单位：Analyze→Set Scale。在弹出的对话框“Unit of length”后面填上“pixels”，其他的不用改动。

7、把WB图片转换成亮带：Edit → Invert。

8、选择菜单栏下的不规则圆形工具，将圆圈手动拉倒第一条带，并尽量将条带都圈起来。

9、点击菜单栏Analyze下拉出现的measurement，即可弹出你选定区域的灰度统计值。也可以点击快捷键（英文状态下的键盘m）。

10、手动移动不规则圆圈至下一条条带，重复8、9步骤，直至所有条带都被测量。

11、当测定完所有条带，选结果中的“Edit”的“Select All”，然后复制数据“IntDen”到Excel表即可进行分析。也可以直接在Results对话框中，选择File → Saveas，直接导出excel表格。

12、在excel表格中将目的蛋白的灰度值除以内参蛋白的灰度值，进行归一化处理。

13、在GraphpadPrism软件中作柱状图。

经过灰度统计分析后得到的结果更准确更有说服力，是不是感觉上升了一个档次呢？