科研| CHEMOSPHERE：代谢组和转录组联合揭示DEHP暴露下MCF-7细胞增殖的分子机制（国人佳作）
编译：雪域，编辑：谢衣、江舜尧。
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邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯（DEHP）是最重要的环境污染物之一，在人体内暴露时会产生多方面的影响。DEHP可以在很低剂量的条件下诱导MCF-7细胞增殖；然而，DEHP与细胞增殖之间潜在的作用机制尚不清楚。因此，该文采用了代谢组和转录组联合分析的方法用以研究DEHP暴露下MCF-7细胞增殖的分子机制。在本文中，作者选择1 μM浓度DEHP处理 MCF-7细胞48h后进行代谢组和转录组分析。非靶向和靶向代谢组学确定8种差异代谢产物，包括氨基酸，嘌呤，嘧啶和核苷酸。研究发现这些代谢物的变化与9种代谢途径有关。其中DEHP暴露造成的，对MCF-7细胞转录组学研究发现总共有500个差异表达基因（DEG）。KEGG富集分析表明，癌细胞相关途径有更明显的表现。代谢组和转录组联合分析结果揭示嘌呤代谢途径具有显著的变化，这将有助于阐明DEHP暴露后MCF-7细胞增殖机制。总之，该项研究阐释了DEHP暴露对MCF-7细胞增殖潜在的作用影响，同时表明omics组学平台还可在深入研究内分泌干扰物毒性机制方面发挥更多作用。
论文ID
原名：A comprehensive analysis of metabolomics and transcriptomics reveals new biomarkers and mechanistic insights on DEHP exposures in MCF-7 cells
译名：代谢组学和转录组学联合揭示DEHP暴露条件下MCF-7细胞中新的生物标志物以及分子机制
期刊：Chemosphere
影响因子：5.778
通讯作者：钱永忠；许彦阳
作者单位：中国农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所农产品质量安全重点实验室
发表时间：2020年04月24日
实验设计
实验结果
1 细胞活力测定
采用CCK8法测定不同系列浓度DEHP处理后MCF-7细胞的活力，结果表明，五组不同浓度DEHP（10 nM-100 μM）处理后细胞活力均显著增强，增值率为115.5％-129.1％。当采用 1 μM DEHP处理后，该组细胞增值率相较其组最高（图1）。因此，选择1 μM浓度DEHP处理组进行代谢组和转录组分析。
图1 不同浓度DEHP处理对MCF-7细胞活力的影响** p <0.01
2 多元统计分析
该文基于UHPLC-QTOF / MS平台建立了高通量，非靶向的分析方法，并采用正离子和负离子模式检测对照组以及DEHP处理组之间的胞内代谢变化水平。最终检测到400多种代谢物，含有代谢物的m / z，保留时间和峰强度等信息。
采用无监督多元分析以初步评估由DEHP处理引起的代谢变化情况。在正离子模式和负离子模式条件下的PCA评分图显示了DEHP处理组和对照组以及QC样品之间的二维分布。结果表明QC组样品在一个很小的区域内紧密聚集，表明仪器分析稳定且结果可信。
使用OPLS-DA可以更准确的分析DEHP处理组与对照组之间的差异。结果表明在正离子模式和负离子模式中DEHP组与对照组之间存在明显差异，表明DEHP会引起细胞代谢产物发生明显变化。
作者通过绘制火山图以筛选对照组和处理组之间的差异代谢物。在图中，每个点代表一个从色谱峰中提取的代谢物。如图2所示，在正离子和负离子模式中，分别有76和26种代谢物发生上调（红色圆圈），25和43种代谢产物（蓝色圆圈）发生下调，而其他的则没有明显变化（灰色圆圈）。在火山图中，数据点距原点越远，表明其在区分两组之间的作用就越大。因此，远离原点的点可被视为DEHP暴露条件下的候选生物标记物。
图2 火山图。该图显示了暴露于1 μM DEHP后在正离子模式（A）和负离子模式（B）下代谢产物的变化情况
3 候选生物标志物的鉴定
采用质谱信息采集（IDA）技术获得串联质谱数据，并将获得的MS数据注释到HMDB和KEGG数据库中。根据VIP> 1且有显著差异（p <0.1）的原则，鉴定出14种显著变化的代谢物作为候选生物标志物，主要包括氨基酸，嘌呤，嘧啶，核苷酸和各种衍生物。
4 代谢通路分析
进一步研究发现这些发生变化的代谢物涉及9个代谢途径：其中组氨酸参与4个代谢途径，即组氨酸代谢、β-丙氨酸合成、氮代谢和氨酰基-tRNA生物合成。发光色素参与核黄素的代谢；胞嘧啶参与嘧啶的代谢。每个代谢途径在图中均显示为彩色圆圈。圆圈的颜色深度、大小和距原点的距离表明了DEHP暴露对整体代谢物分布的影响。 从图3中可以看出，组氨酸代谢，核黄素代谢，β-丙氨酸代谢和氮代谢是受DEHP影响最主要的四个途径。
图3 暴露于DEHP条件下MCF-7细胞的代谢途径分析。每个圆圈代表代谢途径，红色表示上调，黄色表示下调。 圆圈的大小表示相对影响值
5 采用靶向代谢组学对代谢物进行定量分析
为了验证和分析在非靶向代谢组学研究中得到的代谢变化结果，使用靶向代谢组学检测了差异代谢物的含量。通过绝对定量分析的方法最终确定了8种差异代谢物。8种代谢物的RSD值如图4A所示。可以看出，所有目标化合物的RSD均小于20％，表明在我们的研究中代谢物提取方法是可靠且稳定。
该文中作者进一步采用S线图显示对照组和DEHP处理组样品中8种代谢物的变化情况（图4B）。与S形图相比，S线图可提供更清晰的变量表示形式，如图4B所示，DEHP处理组中8种代谢物的浓度变化趋势相似，并且所有代谢物在暴露于1 μM DEHP 48小时后均显示出明显的下调。根据VIP> 1且有显着性差异（p <0.05）的原则，胞嘧啶，r-L-谷氨酰-L-缬氨酸和2-羟基腺嘌呤可鉴定为生物标志物（图4C）。
图4 代谢物的定量分析 （A）MCF-7细胞中8种代谢物的RSD（％）。（B）对照组和DEHP处理组中8种代谢产物的变化。x轴以下的化合物表示代谢物被下调。（C）对照组和DEHP处理组中胞嘧啶，r-L-谷氨酰-L-缬氨酸和2-羟基腺嘌呤的浓度。**表示与对照组相比，p值<0.01
6 MCF-7细胞DEHP组的转录组学分析
RNA-Seq结果表明，在对照组和DEHP处理组中，表达的基因总数不同。与对照相比，在暴露于1 μM DEHP 48小时的MCF-7细胞中发现了1516个显着上调的基因和1155个下调的基因。图5火山图中的红点代表了DEG基因的变化情况。
图5 MCF-7细胞中差异表达基因（DEG）的火山图。红色和绿点表示基因差异表达，蓝点表示基因未差异表达。log 2 FoldChange的正值和负值分别表示DEG的上调和下调
7 DEG的GO和KEGG富集分析
作者进一步对DEG进行了GO和KEGG富集分析。当MCF-7细胞暴露于1 μM DEHP时，MCF-7细胞的上皮形态，细胞粘附结合分子以及细胞内负调控过程发生明显的改变。为了说明DEG与代谢途径之间的关系，作者使用KEGG数据库进行了通路分析，结果显示癌细胞相关途径中37个上调和6个下调途径发生了显著变化。KEGG分析表明，DEHP处理组的“代谢通路”受到了干扰，表明DEG与代谢产物之间存在密切关系。
8 差异代谢物和基因的网络分析
为了在转录组水平上阐明暴露于DEHP条件下MCF-7细胞的代谢反应机制，作者使用Cytoscape（v3.6.1）建立了一个相吻合的差异代谢物和DEG网络（图6）。结果发现参与嘌呤代谢的酪氨酸蛋白磷酸酶非受体7型（PTPN7）和ATPase Naase /Kþ转运亚基beta 2（ATP1B2）在DEHP处理组的MCF-7细胞中表现出明显的变化。
讨论
该研究中细胞活力测定结果表明不同剂量的DEHP进行处理均可以不同程度地提高细胞活力。细胞增殖试验结果与前人的研究基本一致，表明DEHP可以在非常低的浓度下诱导细胞增殖。该文中采用的试验浓度（1 nM-100 μM）涵盖了食品和农产品中可能存在的浓度范围。
在基于代谢途径分析的四个显著变化的通路中，核黄素代谢在DEHP诱导的MCF-7细胞增殖中起重要作用。核黄素是黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸生物合成的重要微量营养素，已被认为是多种晚期疾病状态的重要因素。Lumichrome是核黄素的主要降解产物，在本实验中其被下调。 据报道，Lumichrome可抑制核因子B配体（RANKL）诱导的NF-κB的受体激活和MAPK途径的激活，这对MCF-7细胞的增殖有重要的影响。研究发现在癌症中起关键作用的胞苷三磷酸合酶（CTPS）与组氨酸有关，在实验组中L-组氨酸浓度明显增加，组氨酸诱导的CTPS细丝形成可能是癌细胞用来确保在不利环境中生长优势的一种自我保护策略。
β-丙氨酸是丙氨酸的一种异构体，是参与细胞生长和生理代谢中一种重要的氨基酸。β-丙氨酸还可激活甾体激素的重要调节剂甘氨酸和γ-氨基丁酸（GABA A）受体。据报道，DEHP可以通过影响类固醇激素的合成来干扰内分泌系统。氮是蛋白质的基本成分，肿瘤中对RNA和DNA的需求很高。许多癌症（乳腺癌，肝癌等）可能会主动调节宿主的新陈代谢，从而增加其氮的供应促进其生长和进展。氮代谢物也被报道可作为早期癌症检测的生物标记物。4-胍基影响精氨酸和脯氨酸的代谢途径，这可能会干扰免疫和内分泌功能。
在过去研究中相继报道了涉及细胞增殖和分化的几种代谢途径。 研究人员主要关注PI3K / AKT / mTOR，NF k B和Ras通路。但是，目前还没有如核黄素，β-丙氨酸，组氨酸代谢和氮代谢等有关代谢途径的报道。在这项研究中，我们首次发现4种代谢途径发生了显着变化，并增强了MCF-7细胞的增殖活力。
通过靶向代谢组学分析，R-L-谷氨酰-L-缬氨酸，胞嘧啶和2-羟基腺嘌呤被鉴定为生物标记物。R-L-谷氨酰-L-缬氨酸具有调节激素分泌、生理活性物质的前体等多种生物学功能，在该研究的实验组中减少了6.1倍。胞嘧啶参与嘧啶的代谢，试验结果表明其降低了7.1倍。2-羟基腺嘌呤在DEHP暴露组中被下调了2.2倍。嘌呤是核酸（DNA和RNA）的主要物质基础之一，可为细胞提供必需的能量和辅助因子。靶向代谢分析结果表明参与嘌呤代谢的两种代谢物（1-甲基腺苷和2-羟基腺嘌呤）发生了变化。由于尚无针对性的代谢组学研究揭示DEHP与细胞内代谢物变化之间的关系，本研究为DEHP暴露与细胞内代谢物变化之间提供了新的研究思路。
评论
总之，该项研究中相关代谢途径关键代谢物以及相关DEGs调控基因的发现可为揭示DEHP暴露下乳腺癌细胞发生增殖变化的分子机制提供有价值的参考依据。
原文网址：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0045653520310584