编译：小北，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
肿瘤微环境（TME）由不同的细胞群体构成，包括基质细胞、免疫细胞、内皮细胞以及肿瘤干细胞。TME在肿瘤异质性维持、肿瘤发展以及耐药性方面发挥重要的调节作用。在TME中通过细胞外颗粒的分子转运开始成为细胞通讯中的重要信使。外泌体是细胞外的液体小泡，携带一系列的分子包括蛋白、脂质以及核酸。通过肿瘤细胞释放的外泌体miRNA，能够调节TME中细胞的表型变化促进肿瘤的生长和治疗耐药性，例如成纤维细胞-和巨噬细胞诱导的分化。肿瘤干细胞能够转运并且通过释放外泌体miRNAs，靶向抗凋亡和免疫抑制的信号通路，进而提高邻近敏感肿瘤细胞的耐药性。外泌体可通过携带ABC转运体引起耐药，将化疗药物输出受体细胞，降低药物的浓度至不佳的水平。外泌体生物抑制剂代表了一种具有前景的辅助治疗方式，以避免肿瘤细胞获得性耐药表型的出现。总之，外泌体miRNAs在TME中扮演重要角色，赋予了肿瘤细胞耐药性和生存能力，研究者在本研究中强调了该领域未来研究的必要性。
原 名：Role of Exosomal miRNAs and the Tumor Microenvironment in Drug Resistance
译 名：外泌体miRNA和肿瘤微环境在耐药中的作用
期 刊：Cells
影响因子：4.366
发表时间：2020年6月11日
作者：Fausto Almeida
单位：圣保罗大学
DOI：10.3390/cells9061450
原发性人类肿瘤包含基因和表型不同的细胞亚群。从非癌细胞到癌细胞的最初转变是由基因、表观和表型改变驱动的，从而导致细胞过度生长、死亡信号受到抑制、诱导血管生成和治疗的耐药性。基因组的不稳定，例如染色体数目和结构的改变是肿瘤异质性的原因之一，对肿瘤的起始和发展至关重要。肿瘤起始过程中细胞内基因的多样性是不同来源突变累积的结果，例如UV辐射和内生过程，如DNA复制过程中的错误。除了肿瘤起始后发展的线性，肿瘤的发生也是一个动态的过程并且肿瘤细胞通过持续进化以维持肿瘤的异质性。除了基因的多样性，肿瘤微环境（TME）由于能够塑造肿瘤和非肿瘤细胞的表型对肿瘤的异质性方面发挥重要作用。TME包含肿瘤内或者肿瘤周围不同的细胞类型，例如白细胞、成纤维细胞和内皮细胞，通过血管网络和细胞外间质维持。TME中肿瘤和非肿瘤细胞的交流是通过细胞与细胞之间的联系以及细胞因子和趋化因子等可溶性分子的分泌发生的。由于异质性和适应能力的影响，TME也与不同肿瘤阶段肿瘤细胞行为的维持相关。此外，TME通过肿瘤细胞和周围细胞之间的通讯在保护肿瘤细胞免受药物治疗中扮演重要角色。近期，通过细胞外颗粒（EVs）对生物调节因子的转运备受关注，已经作为细胞内通讯的重要信使。EVs是小的液滴颗粒，能够从几乎所有细胞的薄膜释放。EVs携带脂质、蛋白以及例如DNA、mRNA、miRNA以及非编码RNAs等核酸，能够影响受体细胞的多个生物过程，包括基因表达的改变以及一些信号通路的活化。EVs的三个不同组别是基于生物学进行确定的。质膜中的胞外体（直径100-1000 nm）、正在凋亡细胞的凋亡体（直径50-2000 nm）以及从胞吞到多泡体产生的外泌体（直径30-100 nm）。近期，在肿瘤发展和治疗耐药性肿瘤衍生的外泌体是EV相关病理研究的焦点。肿瘤衍生外泌体参与肿瘤的多个标志事件，包括炎症反应、血管生成、凋亡逃逸、细胞增殖、免疫抑制、侵袭和转移（图1）。肿瘤外泌体影响TME过程肿瘤细胞获得性耐药中细胞和分子过程的过剩，包括细胞周期、DNA损伤、免疫系统监视以及EMT过程。由肿瘤外泌体诱导的耐药通过不同的路线调节，例如直接的药物出口、药物流的准运以及miRNAs的信号通路。肿瘤细胞释放的外泌体miRNAs能够直接诱导从耐药细胞到敏感细胞肿瘤环境中的耐药，或者肿瘤外泌体能够与TME细胞相互作用并且传递miRNAs，调节肿瘤的耐药反应。外泌体miRNA水平转移耐药的表型到敏感的肿瘤细胞已经在不同的肿瘤类型中报道。然而外泌体miRNAs如何与TME相互作用并且赋予肿瘤细胞耐药性并未完全了解。本研究中研究者讨论了近年来肿瘤外泌体作用的机制，聚焦于TME中miRNA相互作用和信号通路，赋予肿瘤细胞生存力和耐药的表型。
一、TME作为肿瘤耐药的重要调节因子
1 药物耐药概述
尽管肿瘤治疗中药物在最初发生阳性反应，肿瘤的耐药仍然是肿瘤患者痊愈的关键因素。药物耐药被划分为固有的和获得性的耐药。固有的耐药性可能是治疗前早期存在的耐药肿瘤细胞，与药物分解、药物转运的改变以及药物和靶分子之间的作用减弱相关。获得性耐药是一组之前药物敏感的细胞产生耐药而导致的细胞再生长。肿瘤细胞基因组、表观、转录组以及蛋白组的变化导致肿瘤的异质性，这与药物的获得性耐药直接相关。一些肿瘤细胞耐药是固有的和获得性耐药因素的结合。此外，药物敏感的肿瘤包含至少一种耐药的细胞克隆通过克隆扩增获得性耐药。
2 肿瘤相关成纤维细胞外泌体miRNAs调节的耐药
已有证据证实TME能够改变化疗反应以利于不同机制的耐药表型。在TME中，肿瘤衍生的外泌体调节肿瘤和基质细胞的通讯，对规避治疗和肿瘤生长有利。近期报道肿瘤衍生的外泌体在TME成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）的分化中发挥重要的作用，能够促进肿瘤的生长、促血管生成、侵入性和耐药的表型。CAFs是TME中最广泛的基底细胞类型，并且在伤口愈合过程中与肌成纤维细胞具有相同的特征。依据Webber等人的报道TGF-1被肿瘤外泌体转运是活化促肿瘤机制所必需的。近期的研究确定了一些细胞类型中肿瘤衍生外泌体miRNAs和CAF分化之间的关系（图2）。MiR-21是促癌的关键调节因子，能够通过调节TGF-1信号通路促进细胞存活以及CAFs的形成和活化。从肝癌HCC病人中分离的外泌体能够通过miR-21负调控肿瘤转录抑制因子PTEN随后上调PI3K/AKT信号通路将正常的肝星状细胞向CAFs转变。同样的，肝细胞中的外泌体miR-1247-30引起肺转移前病灶CAF活化，导致促炎症因子如IL1B、IL6、 IL8的上调以及对索拉非尼治疗的耐药。索拉非尼是晚期HCC由于耐药使整体存活降低的靶向治疗，炎症因子白介素如IL-6等的表达与临床预后以及索拉非尼治疗较差密切相关。在人类黑色素瘤外泌体miRNAs的研究也表明miR-155和miR-210能够引起成人成纤维细胞代谢的改变以提高需氧糖酵解提高转移前微环境。显著的是miR-155和miR-210被认为是促癌的miRNAs，在一些肿瘤中能够驱动治疗的耐药性。
图2. 在TME中肿瘤细胞分泌的外泌体将miRNA转运至纤维细胞导致CAF分化
肿瘤衍生的外泌体miRNAs能够促进CAF分化，在TME中CAFs释放外泌体miRNAs在治疗耐药性中发挥重要作用。二代测序技术表明从CAFs到卵巢癌细胞外泌体对miR-21的转运，通过下调APAF1的表达抑制凋亡促进细胞对特素处理的耐药性。顺铂是一类基于铂的药物，通过在肿瘤细胞DNA内形成加合物引起抗肿瘤的效果，活化DNA损伤应答并且通过凋亡导致肿瘤细胞死亡。然而，近期的报道称CAF衍生的外泌体miR-98-5p能够提高卵巢细胞增殖，并且通过负调控CDKN1A促进顺铂耐药的表型，是细胞周期停滞的关键调节因子。有趣的是顺铂耐药可能是不同CAF衍生的外泌体miRNAs引起的，例如CAF分离的外泌体miR-196a能够在头颈癌中负调控CDNK1B。此外，从CAF外泌体衍生的miR-522赋予了胃癌细胞对顺铂的耐药。吉西他滨是一种一线胰腺癌的化疗药，能够抑制肿瘤细胞中DNA合成。然而在胰腺TME的CAFs中外泌体miR-106b能够通过直接负调控TP53INP1的表达促进吉西他滨耐药。同样的，有研究表明CAF分泌的外泌体miR-146a能通过靶向Snail信号通路加速吉西他滨耐药表型的形成。
3 肿瘤相关巨噬细胞外泌体miRNAs促进耐药
肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是TME中最广泛的免疫细胞群体。TAMs是极其可塑性的细胞能够促进肿瘤血管生成、活化免疫抑制、提高肿瘤细胞的耐药性。在TME中TAM群体与一些肿瘤预后差直接相关。CCL-2是单核细胞的化学引诱物，由肿瘤细胞高水平分泌以招募巨噬细胞渗透到肿瘤中。近期有报道称结肠癌衍生的外泌体携带miR-1246引起巨噬细胞向TAM表型发展。同样有其他报道称肿瘤衍生外泌体能够携带促进巨噬细胞向TAMs转换的miRNAs，包括卵巢癌、膀胱癌、头颈癌、皮肤和肺癌。PI3K/AKT信号通路与巨噬细胞极性直接相关，由此促进肿瘤的转移、侵袭和耐药。一些研究称肿瘤细胞释放的外泌体调节巨噬细胞中PI3K/AKT信号通路相关基因促进TAM的极性。然而目前对耐药性的报道，TAMs释放的外泌体如何引起肿瘤的耐药性尚不明确。鲜有报道探究TAMs衍生的外泌体miRNAs在耐药中发挥的作用。例如，TAMs能够赋予肿瘤表型，通过转运外泌体携带的miR-223促进卵巢癌上皮细胞的耐药。另一项吉西他滨耐药的报道称胰腺癌细胞通过外泌体衍生的TAMs传递miR365。与CAFs同样一旦活化，TAMs能够在细胞外环境中通过释放携带miRNAs的外泌体进入一个抗炎症的免疫抑制阶段调节TME。例如，TAM衍生的外泌体miR-21能够导致胃癌细胞通过抑制肿瘤细胞凋亡并且活化PI3K/AKT信号通路对顺铂耐药的表型，这与之前报道的HCC细胞释放的外泌体miR-21的机制类似。
4 肿瘤干细胞外泌体调节的药物耐药传递
肿瘤干细胞（CSCs）在TME中是自我更新的群体能够激发对抗癌药和化疗的耐药性。CSCs通过一些表面标记物如CD44+的高表达和CD24-的低表达确定。CSCs与肿瘤增殖、转移以及复发存在很强的关联。在一些研究者中CSC群体被认为是原发性肿瘤发展为转移性肿瘤中耐药表型的一个资源。近期的研究证实CSCs衍生的外泌体能够与周围其他TME和肿瘤细胞相互作用，通过释放外泌体促进肿瘤的发生发展。在TME中CSCs衍生的外泌体调节的机制包括CAF的活化和TAM的表型分化、促进血管的发生以及EMT过程。然而，CSC衍生外泌体在耐药中的作用很少报道。尽管肿瘤细胞和CSCs中的外泌体miRNAs表现出分化特性，它们在一些肿瘤中对肿瘤表型发挥作用。有趣的是对CSC衍生外泌体的研究发现CSC衍生的外泌体miRNAs能够将耐药性转运至敏感的肿瘤细胞。例如Santos等人的一项研究表明CSC衍生外泌体对miR-155的转运能够提高乳腺癌细胞对阿霉素和紫杉醇治疗的耐药性并且获得EMT表型。近期利用体内外的方法，杨等人发现吉西他滨耐药的胰腺癌CSCs外泌体携带高水平的miR-210能够将耐药的表型转移至敏感的细胞中，由此抑制凋亡并且通过靶向mTOR信号通路促进增殖。
图3 肿瘤干细胞衍生外泌体在肿瘤微环境中调节耐药性的机制
CSCs最主要的特征是对传统药物治疗的抵抗。尽管miRNAs向邻近细胞的转运受外泌体调节，CSCs在一些肿瘤中由于ABC转运体的过表达导致对多个药物的耐药性。ABC家族成员例如ABCB1、ABCC1、ABCG2作为多个分子如抗癌药物的转运体到细胞外环境。一些细胞毒性的药物例如顺铂、特素、阿霉素是ABC转运体的底物。ABC转运体能够降低细胞内化疗药物的水平，导致细胞在治疗的条件下存活。
近期发现ABC药物外排泵与耐药细胞外泌体合并，并且同时转运至敏感的细胞中。耐药细胞外泌体准运P- 糖蛋白到邻近细胞是一些肿瘤中ABC转运体耐药的一个主要机制。多西他塞耐药的乳腺癌MCF-7细胞能够通过外泌体转运P-糖蛋白到敏感细胞促进耐药。同样利用体外实验和临床初步研究，Corcoran等人发现前列腺外泌体释放的P-糖蛋白能够引起表型向细胞增殖的改变，能够导致多西他赛耐药向敏感型转变的显著增多。获得性耐药同样在卵巢癌中发现，在人类A2780卵巢癌细胞在特素耐药A2780细胞外泌体转运P-糖蛋白之后对特素无响应。此外近期的研究确定了6个不同的miRNAs (miR-204-5p、miR-139-5p、miR-29c-5p、miR-551b-3p、miR-29b-2-5p、miR-204-3p) 与阿霉素耐药肿瘤细胞外泌体转运的耐药相关。作者报道在阿霉素耐药的肺癌和慢性髓性白血病细胞中转运外泌体miRNAs调节P-糖蛋白能够提高敏感细胞的耐药性。
5 外泌体miRNAs调节的EMT
EMT过程是肿瘤细胞失去顶基极性和细胞连接以获取间质的特性，例如形态的延长导致高度的可塑性和移动性。由于高度侵袭的表型，EMT细胞与肿瘤的发展、转移以及耐药性直接相关。基底细胞如CAFs在TME中对EMT驱动的耐药发挥重要作用。CAFs能够通过促炎症细胞因子的旁分泌调节EMT过程，由此促进EMT过程中的细胞耐药。此外EMT与CSCs紧密相关，包括细胞表面标记物CD44+和CD24-以及相似信号通路的活化，例如Hedgehog、Wnt、Notch等。正如之前报道的一样，CSCs通过ABC转运体引起药物流过量促进耐药，有报道称正在进行EMT细胞能够高表达ABC转运体，包括P-糖蛋白。近些年，越来越多的证据证实癌症衍生的外泌体能够调节TME中EMT过程。Xiao等人的研究提供了有力的证据证实肿瘤外泌体能够促进EMT过程。在他们的研究中，原发性黑色素瘤衍生的外泌体通过转运与EMT调节直接相关的miRNAs如let-7a和miR-191引起原黑色素细胞的EMT过程。耐药内皮细胞释放的外泌体引起EMT过程并且促进鼻咽癌细胞对阿霉素的耐药。越来越多的研究证实通过活化或者稳定EMT能够影响原发性肿瘤细胞外泌体miRNAs。近期HCC耐药细胞系（对索拉非尼、吉西他滨、奥沙利铂以及5-氟尿嘧啶耐药）携带外泌体miR32-5P到HCC敏感的细胞，导致PI3K/AKT信号通路的活化，并且通过血管再生和EMT引起耐药性。紫杉醇耐药的胃癌细胞MGC-803释放的外泌体miR-155-5P能够引起EMT肿瘤表型并且通过抑制GATA3和TP53INP1提高对紫杉醇的耐药性。在另一项研究中，利用miR-128-3P转染正常的肠细胞，并且它们的外泌体与奥沙利铂耐药的结肠癌细胞共培养，结果显示miR-128-3p能够通过上调E-cadherin的水平以及结肠癌细胞中奥沙利铂的浓度抑制EMT。这些结果为基于外泌体的治疗策略提供了依据。
6 肿瘤外泌体miRNAs引起自噬
自噬是异化的过程，对消除损伤的或者过量的大分子或者细胞器维持内稳态和代谢发挥重要作用，有报道证实自噬同样在肿瘤生长和耐药中发挥双重作用。在肿瘤起始过程中，自噬水平升高需要较高的能量供应和较多的细胞存活。高水平的自噬与缺氧的TME直接相关，这导致氧化应激、延迟凋亡细胞的死亡以及治疗耐药，这一现象称为细胞保护性自噬。癌症外泌体和自噬之间的通讯引起了研究者极大的关注，并且经报道发现这一相互作用是动态变化的，与肿瘤的需求直接相关。例如，在细胞压力下，外泌体和自噬的水平升高赋予肿瘤细胞适应性。另一方面，肿瘤衍生的外泌体也能够促进ROS的形成，在受体细胞中自噬的水平升高促进了肿瘤生长因子的分泌。最终在药物治疗下肿瘤细胞释放外泌体导致受体细胞的保护性自噬水平升高，进而导致耐药的表型的出现。研究发现外泌体miRNAs能通过靶向特异的自噬相关信号通路控制受体细胞的自噬。近期，一些研究表明外泌体miRNAs作为自噬调节因子在治疗耐药中发挥重要的作用。例如在顺铂耐药的非癌NSCLC细胞中衍生的外泌体miR-425-3p能够通过靶向AKT1/mTOR信号通路降低对顺铂的应答，导致自噬活性的升高。同样的结果在Ma等人的研究中也观察到了，顺铂耐药的NSCLC外泌体miR-425-3p能够促进自噬的活化并赋予敏感细胞耐药性。基于上述研究，研究者提出假说miR-425-3p是NSCLC中预测顺铂响应的潜在生物标记物。曲妥单抗耐药乳腺癌患者中得到的细胞显示外泌体miR-567的表达显著低于敏感患者。利用体内外的方法发现miR567在曲妥单抗耐药的细胞中水平降低。此外miR-567能够抑制曲妥单抗引起的自噬并且逆转获得性耐药。这些结果提示肿瘤细胞能够负调控外泌体miRNAs，以控制其抗肿瘤的机制以及邻近细胞的药物敏感性。
二、通过外泌体生物合成抑制剂提高药效
如上所述，外泌体miRNAs能够调节一些不同的分子机制以及邻近肿瘤细胞或者TME相关细胞的信号通路，这不仅影响肿瘤的生长、转移和治疗的耐药性，也抑制了肿瘤抑制因子的表达。相较于非癌细胞，肿瘤细胞能够释放更多的外泌体进入TME，这意外着在TME中外泌体的循环是广泛存在的。依据Sharma的研究，靶向外泌体及其miRNAs，包括封闭外泌体的生物合成是克服耐药性的合理举措。尽管外泌体的生物合成尚未完全了解，一些成分已经确定为外泌体生物合成的潜在抑制剂。GW4869是一类药理剂，在不同肿瘤包括前列腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌等中抑制外泌体的生物合成具有前景的效果。此外通过GW4869抑制外泌体生物合成结合硼替佐米在体内具有很强的抗肿瘤效果。例如，一项有趣的研究报道了一些其他的成分可作为前列腺癌细胞中外泌体生物合成和分泌的有效调节因子，包括法尼基转移酶抑制剂，如替皮法尼布和马诺霉素A，唑类抗真菌药，如氯咪巴唑、酮康唑、奈替康唑。同样，近期的研究表明马诺霉素A在前列腺癌细胞中能够通过靶向抑制Ras/Raf/ERK信号通路抑制外泌体生物合成和分泌。硫代异唑是一类抗菌药，近期作为乳腺癌外泌体生物合成的抑制剂被确定。此外，硫代异唑联合多西他赛能够降低肿瘤细胞异种移植小鼠模型的增殖和转移。氯脒和双吲哚马来酰亚胺的结合治疗能够在耐药前列腺和乳腺癌肿瘤细胞中抑制外泌体的生物合成。这些成分协同效应靶向特异的细胞外颗粒生物合成信号通路并且提高了导致肿瘤细胞凋亡5-氟尿嘧啶的效果。同样消炎痛，一种非甾体的抗炎症药物被证实是ABC转运体表达的有效抑制剂，能够在体外提高B淋巴细胞瘤中匹杉群马来酸盐和阿霉素的抗肿瘤效果。正如之前报道的，通过外泌体对ABC转运体转运对维持耐药表型非常重要。
上述结果强调了外泌体生物合成抑制剂在提高药物的治疗效果并且克服治疗的耐药性方面具有广阔的前景，对于外泌体生物合成和外泌体调节耐药方面有待进一步探究。
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