科研 | Cancers：单细胞转录组分析揭示了典型霍奇金淋巴瘤肿瘤微环境中的基于疾病定义的T细胞亚群

编译：艾奥里亚，编辑：十九、江舜尧。

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导读

霍奇金淋巴瘤（HL）的特点是该肿瘤微环境（TME）主要由不同类型非癌性免疫细胞和罕见的恶性细胞所主导。细胞成分及其空间关系的表征对于了解TME中的串扰和治疗靶向至关重要。对来自22个HL组织样本和5个活性淋巴结样本中的超过127,000个细胞进行了单细胞RNA测序，首次在单细胞层面下探究了HL特异性免疫微环境的表型。单细胞表达谱鉴定出一种新的与HL相关的T细胞亚群，其显著表达LAG3抗体，功能分析证实这种LAG3⁺T细胞群是免疫抑制的介体。微环境中免疫细胞的多重空间分析同样表明在MHC-II类缺陷肿瘤细胞的附近LAG3⁺T细胞增加。本研究发现为TME生物学提供了新的见解，并为HL的免疫检查点靶向提供了新的方法。

论文ID

原名：Single cell transcriptome analysis reveals disease-defining T cell subsets in the tumor microenvironment of classic Hodgkin lymphoma

译名：单细胞转录组分析揭示了典型霍奇金淋巴瘤肿瘤微环境中的基于疾病定义T细胞亚群

期刊：Cancers

IF：26.37

发表时间：2019年12月

通讯作者：Christian Steidl

通讯作者单位：加拿大不列颠哥伦比亚癌症机构（British Columbia Cancer）

DOI号：10.1158/2159-8290.CD-19-0680

主要内容

1 单细胞层面下的cHL特异性免疫微环境

为了探究典型霍奇金淋巴瘤（cHL）肿瘤微环境（TME）中免疫细胞的转录特征，研究者对22例cHL患者的淋巴结单细胞悬浊液进行了scRNA-seq分析，这其中包括动脉粥样硬化（NS）亚型12例，混合细胞（MC）亚型9例，富于淋巴细胞（LR）亚型1例。同样，作为对照，对来自健康供者的活性淋巴结（RLN；n=5）进行了测序。基于测序，共获得127,786个活细胞的转录组数据，每个细胞检测到基因的中位数为1,203个。为了对cHL患者TME和RLN之间进行系统的比较分析，我们整合了所有细胞（cHL和RLN）的表达数据，并进行了批量校正和归一化处理。

通过分析，在t-SNE空间中可视化识别了22个基于表达的细胞簇，基于已知的免疫细胞分类的转录组数据将这些细胞簇进行注释，并分配到不同的细胞类型中（图1）。这其中包括4个固有的T细胞簇，以及CD8⁺T细胞簇2个，CD4⁺T细胞簇6个，B细胞簇7个，巨噬细胞簇1个，浆细胞样树突状细胞簇1个，祖细胞簇1个。但由于技术上的限制，我们并没有观察到HRS细胞群。虽然大多数免疫细胞表型在cHL和RLN之间显示重叠，但仍有一些特定的细胞簇在cHL患者中被富集（图1B）。其中，三个不同的调节性T细胞（Treg）群在数量上都由来自cHL样本，只有少部分来自RLN（图1C），并且与RLN相比，cHL样本中分配给Treg簇的细胞比例明显高于其在RLN中的比例（P=0.0001；图1D）。cHL样本中的免疫细胞比例最高的细胞群（CD4-C5-Treg）也显示出相对较高的LAG3和CTLA4表达（图1A）。相反，RLN中富集的细胞群主要以B细胞和CD8⁺T细胞簇为主（图1C）。对非Treg CD4⁺T细胞簇的进一步检查显示，它们主要由2型T辅助细胞（Th2）组成，与RLN相比，Th1和17型辅助细胞（Th17）细胞在cHL样本中被富集（图1E）。

图1 霍奇金淋巴瘤微环境的单细胞分辨免疫细胞图谱。A以热图形式总结了在不同细胞簇中所选的规范标记的平均表达；B代表来自cHL和RLN的所有细胞在tSNE空间中的单细胞表达；C代表来自cHL和RLN样本的每个簇中的细胞比例；D计算了每个样本分配给某一特定免疫细胞类型的细胞比例；E以箱线图的形式表述了CD4+T细胞(非Treg)分配到不同的亚群的比例；F-G代表D-E免疫细胞类型的比例（根据EBV状态进行的分类）；H代表E中免疫细胞类型的比例（以组织学亚型进行分类）

2 EBV状态影响cHL免疫细胞亚群组成

30~40%的典型霍奇金淋巴瘤（cHL）与恶性hodgkinand reed-sternberg（HRS）细胞潜伏的EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染有关，有研究发现，EBV感染可以将特定的Treg群体募集到典型霍奇金淋巴瘤（cHL）肿瘤微环境（TME）中。EB病毒感染的cHL中具有Th17型的CD4⁺ T细胞比例显著降低（P=0.004）（图1F-G）。然而，在CD8⁺T细胞或Treg比例方面，EBV⁺和EBV^-两组之间并没有显著差异（图1F）。同样，与结节性硬化症（Ns）亚型相比，cHL混合细胞性（MC）亚型与Th17极化的免疫细胞的比例较低（图1H）。

3 新型cHL特异性免疫亚群的单细胞表达模式

数据表明，与RLN相比，Tregs优先富集于典型霍奇金淋巴瘤（cHL）中（图1B和D）。考虑到免疫抑制微环境作为癌症标志的重要性，以及它对生物标记物开发和靶向免疫治疗的影响，研究者将分析重点放在Treg亚群的具体特征上。cHL含量最高的Treg簇，CD4-C5-Treg（图1A），除了常见的Treg标记物外，还表现出LAG3的高表达（图2A）。但其他典型的Treg标记物（如FOXP3）并没有表现出相同的表达模式，这表明这些细胞可能表现出1型调节（Tr1）T细胞表型（图2B）。

为了更深入地了解抑制性受体在cHL的TME中的表达特点，探索了单个T细胞的表达模式。其中表达LAG3的细胞主要分布在Treg簇中，而表达PD-1的细胞主要分布在非Treg CD4⁺T细胞簇中（图2C）。有趣的是，包括CTLs在内的CD8⁺T细胞并不是PD-1和LAG3表达的优势群体（图2C-D），这表明CD4⁺T细胞群体对cHL免疫检查点调控的重要性。值得注意的是，抑制性受体在不同的T细胞亚群中表现出不同的表达模式（图2E），这表明每个抑制性受体在cHL中的每个T细胞亚群中都有特定的作用。在单细胞水平上的共表达模式分析表明，大多数LAG3⁺表达的T细胞中同时表达CTLA4，但PD-1并未表达（图2F）。

为了探究LAG3⁺ T细胞的功能作用，基于扩散映射探究了CD4⁺ T细胞之间的分化状态（图2G）。大多数T细胞按PhenoGraph聚类进行分组，第一维显示出以naïve T细胞开始，以Tregs结束的轨迹。LAG3⁺ T细胞在该维度的远端富集，与代表末端分化特征的基因相关。

图2 经典霍奇金淋巴瘤肿瘤微环境中调节性T细胞的详细特征和共表达模式。A以小提琴图形式显示Treg功能相关基因表达值分布；B代表所有Treg簇中共表达Treg标记LAG3和FOXP3的单个细胞数；C代表每个簇中LAG3和PDCD1（PD-1）阳性细胞的比例；D代表LAG3和PD-1阳性细胞在所有Tregs、CD4⁺T细胞(非Tregs)和所有CD8⁺T细胞中的比例；E以热图形式展现了簇亚集抑制性受体的平均表达情况；F代表LAG3⁺Treg簇中单个细胞抑制性受体(LAG3、PD-1、TIGIT、TIM3和CTLA4)共表达模式的UpSet图；G以扩散图形式分析所有CD4⁺T细胞簇的细胞轨迹。

4 细胞株上清液可诱导LAG3⁺ T细胞

为了研究Tregs在典型霍奇金淋巴瘤（cHL）中的免疫抑制特征，探究了LAG3⁺T细胞的细胞因子表达。在CD4⁺家族的T细胞中，与LAG3^- T细胞相比，LAG3⁺ T细胞的免疫抑制细胞因子IL-10、转化生长因子-β（TGF-β）和干扰素-γ（IFN-γ）表达量较高（图3A）。这些特征与1型调节性T细胞的特征一致。

基于以上的数据研究者推测HRS细胞产生的细胞因子或趋化因子可能影响cHL的肿瘤微环境（TME）。因此，进一步探究了不同淋巴瘤细胞系上清液转移对T细胞体外扩增的影响。T细胞活化14天后，当与CD4⁺，CD25⁺ T细胞cHL细胞上清液共培养时，其所表达的LAG3水平明显高于与弥漫性B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞上清液共培养或仅与培养基共培养时所产生的LAG3量（图3B-C）。Luminex分析表明，与已知可促进Treg迁移和分化的DLBCL细胞株相比，cHL细胞株培养上清液导致多种细胞因子和趋化因子的富集（图3d）。与scRNA-seq结果一致，FACS分离的CD4⁺ LAG3⁺ T细胞分泌的IL-10和转化生长因子-β显著高于CD4⁺LAG3^- T细胞所分泌的IL-10（图3E）。值得注意的是，CD4⁺ LAG3⁺ T细胞在体外共培养时抑制了CD4⁺T细胞增殖的应答，证实了LAG3⁺ T细胞的免疫抑制功能（图3F）。

图3 cHL的特征是微环境的免疫抑制并与LAG3表现出正相关关系。A以密度图的形式表达了LAG3⁺Treg簇(CD4-C5-Treg)细胞抑制性细胞因子的表达；B通过流失细胞仪分析了PBMC中分离的T细胞分别与cHL细胞株，L-1236以及单独与培养基培养，CD25和LAG3的表达；C代表cHL细胞系(KM-H2、L-428和L-1236)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系(OCI-Ly1和Karpas-422)和单纯培养基培养的CD4⁺T细胞中LAG3⁺细胞的比例；D通过Luminex分析，显示了cHL和DLBCL细胞培养上清液中细胞因子和趋化因子的含量；E通过Luminex分析，显示了FACS分选的CD4⁺LAG3⁺细胞和CD4⁺LAG3^-细胞培养上清液中细胞因子和趋化因子的含量；F左侧代表了CD4⁺应答T细胞增殖的代表性实验(下)，与FACS分选的CD4+LAG-T细胞共培养(中)，或与FACS分选的CD4+LAG3+T细胞共培养，右侧代表了每种共培养条件下增殖的CD4⁺应答T细胞相对于正常增殖率的百分比。

5 LAG3⁺细胞以及HRS细胞的空间评估

进一步探究了LAG3⁺ T细胞和恶性hodgkin and reed-sternberg（HRS）细胞之间的空间关系。免疫组化结果显示，与RLN相比，LAG3⁺ T细胞在cHL的肿瘤微环境（TME）中富集，部分cHL患者HRS细胞被LAG3⁺ T细胞紧密包围（图4A）。单细胞分析表明，LAG3在MHCⅡ类阴性的HRS细胞（n=6）中的表达显著高于其在MHCⅡ类阳性（n=16）中的表达，但这种差异与EBV状态或组织亚型无关（图4B）。当对CD4-C5-Treg簇内的细胞进行分析时，与MHC II类阳性细胞相比，LAG3被鉴定为MHC II类阴性细胞中上调最多的基因（图4C）。免疫组化鉴定结果显示，MHC-II阴性病例不仅LAG3⁺T细胞显著增加，而FOXP3⁺ T细胞明显减少（图4D）。基于多颜色的IHC方法，研究者发现，在MHC II类阴性病例中，HRS周围区域LAG3⁺T细胞密度的显著增加与MHC I类状态、病理亚型或EBV状态均无相关性（图4E）。同样，在MHC II类阴性CHL病例中，CD30⁺细胞（HRS细胞）与其最近的LAG3⁺T细胞之间的平均最近邻距离显著缩短（图4F）。相反，在MHCII类阳性的HRS细胞中，HRS周围的FOXP3⁺T细胞的密度更高（图4E），在这些病例中，HRS细胞到FOXP3⁺细胞的最近邻距离也更短（图4F）。进一步研究HRS细胞和其周围细胞之间的空间关系发现，MHC II类阴性的慢性粒细胞白血病患者中有大量LAG3⁺CD4⁺细胞，但FOXP3⁺CD4⁺细胞较少（图5A）。而MHCⅡ类阳性病例中表现出相反的趋势。

图4 Hodgkin、Reed-Sternberg细胞和LAG3⁺T细胞在cHL肿瘤中的空间分布。

图5 基于HRS MHC-II状态的免疫细胞共表达模式和定位。A代表典型MHC-II阴性和MHC-II阳性cHL病例中细胞的空间定位；B代表队列中基于MHC-II状态的LAG3⁺细胞比例的比较；C代表队列中基于EBV状态的LAG3⁺细胞比例的比较。

6 在大型验证队列中，肿瘤微环境中LAG3⁺T细胞的数量与MHC-II表达的丧失相关

在一项基于IHC对166名接受一线ABVD的治疗的患者的队列中，研究者调查了LAG3⁺T细胞存在的潜在预后价值。与scRNA-seq的结果一致，与MHCⅡ类阳性的HRS细胞相比，MHC II类阴性的HRS细胞其肿瘤组织中LAG3⁺ T细胞的比例显著升高，但与EBV状态无关（图5B-C）。此外，我们观察到LAG3⁺ T细胞数量增加的患者的疾病特异性生存期（DSS；P=0.072）和总生存期（OS；P=0.12）有降低的趋势。

7 CHL中HRS细胞与LAG3 T细胞的相互作用

为了研究cHL患者HRS细胞与微环境的相互作用，通过分析原代HL样本的HRS细胞显微解剖产生的Affymetrix基因表达数据，作者验证了在体外Luminex实验中观察到的细胞因子和趋化因子的高表达水平（图6A）。其中IL-6在体外也可诱导CD4⁺LAG3⁺T细胞表达（图6B），说明IL-6可能在诱导CHL中CD4⁺LAG3⁺T细胞中起到重要作用。在LAG3⁺T细胞与CIITA野生型或基因敲除的L-428细胞共培养中，并观察到在MHC-II阳性的L-428细胞中，LAG-3的表达显著降低，这说明LAG3⁺T细胞功能的负调控是通过MHC-II-LAG3直接相互作用来实现的（图6C）。

图6 HRS细胞与CD4⁺LAGA3⁺T细胞的相互作用。A代表细胞因子和趋化因子在原代HL标本以及活性扁桃体生发中心细胞上的表达；B代表与cHL细胞株(L-1236)上清液、IL-6培养液和单独培养液共同培养后CD4⁺T细胞中LAG3⁺细胞的比例；C左侧代表经CIITA野生型(红色)或CIITA KOL-428(蓝色)共培养后，CD4⁺LAG3⁺T细胞表达LAG3的代表性实验，右侧代表L-428 CIITA突变体与LAG3⁺T细胞共培养后LAG3⁺T细胞的高表达率；D左侧代表从慢性粒细胞白血病临床样本中分离出的CD4⁺T细胞增殖的代表性实验(红色)，以及与慢性粒细胞白血病临床样本中的CD4⁺，LAG3⁺，CD25⁺T细胞共培养的细胞增殖(蓝色)，右侧代表增殖细胞的比例；E代表D中TNFα表达百分比。

8 从cHL临床样本中提取的T细胞在去除LAG3⁺T细胞后被激活

为证实LAG3⁺T细胞在cHL临床标本中的致病作用，从4例CHL患者的细胞悬液中分选了CD4⁺ LAG3⁺ CD25⁺T细胞以及其余的T细胞。在体外采用与CD4⁺ LAG3⁺ CD25⁺ T细胞共培养或单独培养T细胞的处理方式，通过实验观察到与LAG3⁺共培养的T细胞增殖受到抑制，而在没有LAG3⁺培养的T细胞中，细胞内细胞因子肿瘤坏死因子（TFNα）的增殖和表达显著增加（图6D-E）。这些结果支持在cHL临床样本中CD4⁺LAG3⁺T细胞的免疫抑制功能，为靶向LAG3⁺T细胞及其相互作用促进部分患者T细胞重新激活提供了临床前基础。

基于以上的结果，研究者提出了一种免疫抑制的模型，MHC II类阴性HRS细胞（1型）的微环境是高度组织化的，部分是由CD4⁺LAG3⁺T细胞所诱导，而CD4⁺LAG3⁺T细胞又主要由HRS细胞产生的细胞因子和趋化因子所诱导（图7）。综合所有这些结果，推测LAG3⁺T细胞和HRS细胞之间的串扰可能是cHL逃逸的重要机制，这一研究的发现，对差异性检查点抑制剂治疗结果的预测（包括应答持久性和克服耐药性）具有潜在的意义。

图7 经典霍奇金淋巴瘤的LAG3⁺T细胞与HRS细胞相互作用模型

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