荧光定量FAQ专题： 第（一）期
充分的准备是实验成功的关键，那么，qPCR实验需要提前做好哪些了解呢？
1、试剂的储存条件
市面上大多数qPCR试剂推荐 - 20 ℃ 避光长期储存。
Vazyme的ChamQTM和AceQ® 两个系列的qPCR Master Mix，长期储存应置于 - 20 ℃ 避光，解冻后可于4 ℃ 短暂存放；避免反复冻融。
正确的储存方法才能使得试剂的主要成分—酶的活性得到保障哦~
2、原始模板稀释倍数
是不是拿到一个cDNA模板就直接做qPCR？
NO!
是不是直接沿用前辈们的稀释倍数？
NO!
是不是对怎么确定稀释倍数倍感无助？
……
小V推荐的有效做法是：做至少5个数量级倍数连续梯度的模板稀释（包括原始模板在内），尽量选择Ct值落在15-28范围的稀释倍数作为原始模板稀释度。
3、反应体系与次数
推荐20 μl体系，Vazyme ChamQTM/AceQ® QPCR Master Mix 5 ml可供20 μl体系500次反应。
伙伴们问：那用10 μl、25μl、50 μl体系可以吗？
小V回答：可以，可以，必须可以!
Vazyme ChamQTM/AceQ® QPCR Master Mix系2×预混Mix，推荐体系20 μl，只要是等比例放大或缩小体系，实验就能得到保证哦~
4、模板的上样量
若直接使用cDNA原液作为模板，建议使用体积不超过qPCR反应总体积的1/10！
当复孔之间重复性不佳时，可将模板做适当稀释后以大体积加入反应体系，可有效提高实验重复性。看小V做的实验，是不是重复性爆表啊~~~
5、预变性时间
常见的qPCR试剂预变性时间从30 sec - 15min不等。科学家们为了封闭常温下酶的活性，使qPCR产生非特异性扩增的概率降到最低，想出了这种只有在高温下经过一定的时间才能激活并释放活性的酶—热启动酶。
热启动酶多用两种修饰方式：化学修饰和抗体修饰。
例如：
Vazyme的ChamQTM QPCR Master Mix中的 Champagne TaqTM DNA Polymerase 是经过抗体修饰的Taq DNA Polymerase，95 ℃ 加热 30 sec就可以灭活抗体激发酶活。AceQ® QPCR Master Mix中AceTaq®DNA Polymerase是经过化学修饰的Taq DNA Polymerase，在温度低于80 ℃时活性被完全封闭，只有95 ℃加热至少5min酶的活性才被释放。有效防止了在样品准备及反应升温阶段产生非特异扩增和引物二聚体。
6、ROX的选取
ROX：一种不受PCR反应影响的参比染料，可校正单次反应运行中的信号误差、移液误差或蒸发所导致的体积差异，提供更连续一致的重复Ct值。
伙伴们好不容易申请到了一份试用装，然而打开后却发现有两管ROX，到底该怎么选择呢？
小V告诉你：一卡在手，ROX使用从此不用愁！
赶快拿去对照一下自己的仪器，看看应该用哪一个哦~
不同仪器ROX的选取参照卡，拿去~