科研 | ISME：全球含水层土壤中厌氧氨氧化过程是氮流失的主要途径（国人作品）
编译：李春格，编辑：小菌菌、江舜尧。
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地下水是全球重要的淡水资源，在饮用水生产、农业灌溉和全球食品安全中具有重要的作用。地下水储存在可渗透的地质层即含水层中，含水层中氮氧化物污染会产生较高浓度的硝酸盐，硝酸盐可进一步生成致癌物亚硝胺。此外，饮用硝酸盐含量过高的水易诱导高铁血红蛋白血症，缺氧严重者可导致死亡，严重威胁全球环境和人类健康。前期研究普遍认为异养反硝化主导着含水层氮循环系统，是氮流失的唯一途径。而在与地下含水层相结合的陆地亚表层土壤中氮循环的主导过程和转化机制仍然不清楚。
含水层储存的水停留时间长，交换速率相对缓慢，水营养成分含量低，适合生长缓慢的自养型细菌生长。厌氧氨氧化过程由自养型细菌氧化NH4+，还原NO2-生成N2完成，不需要有机物贡献电子；此外，厌氧氨氧化细菌生长缓慢，倍增时间14-20天，适于在水更替速率缓慢的环境中生长；因此，含水层的环境特点适于厌氧氨氧化生长和繁殖。目前研究表明，厌氧氨氧化细菌在海洋和陆地表层水系统广泛发生和分布，氮流失贡献显著。但在地下水中的厌氧氨氧化的氮流失贡献和相关机制仍然不清楚。因此，本文使用同位素示踪技术、生物地理化学和微生物生态研究方法研究了厌氧氨氧化在全球地下含水层的发生、分布、氮流失贡献和生物地理化学过程。
论文ID
原名：Anaerobic ammonium oxidation is a major N-sink in aquifer systems around the world
译名：全球含水层土壤中厌氧氨氧化过程是氮流失的主要途径
期刊：The ISME Journal
IF：9.493
发表时间：2019.10
通讯作者：祝贵兵
通讯作者单位：中国科学院生态环境研究中心
DOI: 10.1038/s41396-019-0513-x
实验设计
本文在全球范围含水层研究厌氧氨氧化作用，分别在澳大利亚、瑞士、德国、莫桑比克、中国等地采集亚表层不同深度土壤样品。使用GeoProbe和PowerProbe钻机设备，每个取样点设置取样区面积为2500平方米，在样区内选择5个平行样方（5m×5m，样区四角和中心部位）收集样品，每个样方内用钻机设备打取5个土柱剖面（样方四角和中心部位），从四角处分别取样，相同深度的这组样品混合均匀成一个样品。中心部位样品用于测量溶解氧，并在中心部位处取地下水样品。每个取样点取土壤样品1-2kg（每个深度）和800-1000mL地下水。所有土壤样品放在无菌袋中，置于冰上被运到实验室，用于分子实验、微生物活性、化学指标等分析测试实验。采集的地下水储存于无菌真空瓶，4℃条件下运到实验室。样品运到实验室后立即使用0.22µm滤膜过滤除去生物体及杂质，保留营养成分用于培养实验。15N同位素示踪技术测定厌氧氨氧化、反硝化和呼吸氨化等氮转化过程的速率潜势。qPCR测定样品的厌氧氨氧化hzs基因的丰度；高通量测序测定样品hzsB基因序列，通过基因序列信息分析微生物之间关系；总氮(TN)、总碳(TC)、总有机质（TOM）、含水率（MC）等指标分别按照常规方法测定，用于分析环境变量对厌氧氨氧化的影响。所有样品单独测量，结果取平均值。
选取的样品具有较高的环境异质性，包括各种土壤类型、基质类型、地球化学性质、有机质含量和组成、遗传分类、地下水位特征、含氮化合物浓度和温度。
结果
1 区域尺度研究
在中国安新设置了6个取样点，共采集285个土壤样品。其中90个样品从非饱和土壤收集，195个样品从饱和土壤收集。分析结果表明，厌氧氨氧化分布随深度发生显著变化。在饱和含水土壤所检测到厌氧氨氧化细菌隶属于Candidatus Brocadia（Ca.Brocadia）和Candidatus Jettenia asiatica （序列相似性97.6–98.8%），基因丰度 4.81 × 103–1.98 × 106 copies g−1(Fig. 1a, b)。与此相反，在非饱和土壤未检测到厌氧氨氧化（低于检测限）。
15N同位素示踪实验表明，厌氧氨氧化活性主要存在于饱和土壤(Fig. 1a, b)，速率潜势变化范围是0.03 -6.69 mmol N m−2 d−1，与厌氧氨氧化细菌丰度具有较高的相关性。这6个取样点均在饱和土壤中检测到氧氨氧化细菌，在非饱和土壤中未检测到。在饱和土壤上部约15%处，具有较高的厌氧氨氧化速率潜势，达到3.38 ± 1.82 mmol N m−2 d−1，生成的氮占氮流失总量的77.9 ± 15.1%，高于反硝化作用。厌氧氨氧化速率潜势随着深度增加而降低，在非峰值潜势，氮流失的贡献仍然达到37.6±29.7%。
图1 （I）全球地下土壤含水层规模性厌氧氨氧化的发生和对氮损失的贡献。饼形图分别表示厌氧氨氧化和反硝化过程对土壤中氮损失的贡献率。（II）区域规模地下含水层厌氧氨氧化的发生，速率和贡献（24 km尺度，中国河北省安新县）。a-f分别代表距离为7.0、7.0、4.0、4.5和1.5 km的不同土壤剖面。（III）全球尺度地下含水层厌氧氨氧化的发生，速率和贡献。速率用通量单位mmol N m-2 d-1表示，浅蓝色和灰色分别代表饱和和非饱和土壤，速率和丰度数据均为平均值±s.e.（标准误差，n = 5）。
2 全球尺度研究
在全球范围内，进一步采集了1070个样品（860个非饱和土壤，210个饱和土壤）。结果显示，所有饱和土壤均存在厌氧氨氧化细菌，其丰度变化范围是1.92 × 104–8.48 × 107 copies g−1。其中，Ca.Brocadia和 Ca. J. asiatica的丰度最高。在210个饱和土壤样品中均检测到厌氧氨氧化活性(Fig. 1a, c)，速率潜势范围为0.02 - 5.01 mmol N m−2d−1。进一步分析表明，厌氧氨氧化速率潜势与土壤组成、地下水深度及环境变量（NH4+、NO3-、NO2-、pH等）均没有明显的相关性，规模性的厌氧氨氧化活动可能是地下含水层土壤的固有属性。
在整个饱和土壤样品中，厌氧氨氧化速率潜势是(6.68 ± 4.17 mmol N m−2d−1)，与反硝化速率潜势（6.81± 6.57 mmol N m −2d−1）相似，在某些样品位点甚至高于反硝化，对氮流失的贡献达到了54.0 ±14.8%。厌氧氨氧化活性处于峰值时对氮流失贡献达到67.5 ± 20.2%，当深度增加时，反硝化和厌氧氨氧化速率潜势都随之较低，即使如此，反硝化对氮流失的贡献仍然达到42.6 ± 28.8%。因此，这篇文章显示了厌氧氨氧化在含水层土壤氮循环中具有重大作用。
3 时间尺度研究
分析表明，厌氧氨氧化速率潜势随着地下水位波动而变化（Fig. 1a, c）。苏黎世采集的样品柱, 从8.4米深（夏季），随水位提高到4.8米深（冬季）检测到厌氧氨氧化活性（[0.08 ± 0.02] – [4.54 ± 0.26] mmol N m−2 d−1），其对饱和土壤含水层氮流失的贡献率，从夏季的55.3%，提高到冬季的77.6%。在昆士兰土壤柱中，秋季时仅在地下0.8m深以下检测到厌氧氨氧化速率潜势，在春季时0.6m深即可检测到。在昆士兰饱和土壤，厌氧氨氧化贡献的氮流失占总氮流失的36.8–63.8%。综上所述，作者推测厌氧氨氧化细菌丰度和活性在全球土壤亚表层含水层显示季节性的波动。
与此相反，在未深入到含水层的土壤样品中均未检测到厌氧氨氧化反应，包括北京28.0m深土壤、莫桑比克7.0m深土壤、卡尔古里（澳大利亚）21.0m深土壤（Fig. 1）。将这些土壤用已灭菌的Milli-Q水培养，同步模拟地下水位线波动，来进一步评估土壤中厌氧氨氧化的速率潜势(Fig. 2a)。作者发现北京土壤培养第一个月厌氧氨氧化细菌仍然低于检测线，在第三个月时达到丰度最高值[5.13 ± 0.87] × 105copies g−1(Fig. 2b)，在第五个月时细菌总数降低到未检出水平，究其原因可能是因为底物不足。莫桑比克7.0m深土壤和卡尔古里21.0m深土壤培养结果与此相似。上述结果表明，当环境中补充了适宜底物的供给，地下水位线的上升可能激活厌氧氨氧化细菌活性并引起细菌增长。
图2 加水模拟地下水位上升条件下厌氧氨氧化细菌的丰度变化。A培养实验流程图：在原位未检出厌氧氨氧化的土壤中，添加Milli-Q 水培养（质量比1:1）。b土壤样品中底物和厌氧氨氧化细菌丰度随培养时间变化。ND表示厌氧氨氧化菌丰度低于检测线（<103 copies g-1）,且没有厌氧氨氧化反应活性检出。数据均为平均值±s.e.（标准误差，n = 5）。
4 多样性和生物地理学分析
基于联氨合成酶hzs基因研究了厌氧氨氧化菌的多样性，在全球含水层系统中检测到了五个厌氧氨氧化属（Fig. 3a），其中，Ca. Brocadiaanammoxidans(Ca. B.anammoxidans) 是主要菌属（90.0–95.3%, p< 0.001, Fig.3a）。Ca. Scalindua 仅在澳大利亚土壤中检出，在厌氧氨氧化中占较小的比例。根据α-多样性和LEfSe分析，厌氧氨氧化群落多样性指数存在较大的异质性（97% cut-off,Fig.3b）。Shannon 和Simpson的多样性指数与主导菌属Ca. B.anammoxidans负相关（p< 0.01），即高丰度的Ca.B.anammoxidans预示厌氧氨氧化群落的多样性较低。统计和网络分析显示TOM、MC、NO2-含量是厌氧氨氧化群落结构和多样性的基本因素，与厌氧氨氧化的丰度呈显著正相关（p<0.05）。
厌氧氨氧化菌的种间交互作用在全球呈现高异质性。厌氧氨氧化菌丰度与Ca. B. anammoxidans（p<0.05）或 Ca. B. fulgida（p>0.05）丰度不具有正相关性，但与Ca. J.asiatica（p<0.01）具有显著正相关性（Fig.3c）。网络分析结果显示，相对丰度低于5%的Ca. J.asiatica是联系厌氧氨氧化群落的关键种类，可能因为该菌属于混合营养代谢类型。而且，Ca. J. asiatica与MC (p<0.001)、TOM (p<0.01)、NO2- ( p<0.01)均有极高的正相关性。上述结果表明MC是影响厌氧氨氧化细胞能量交换的重要环境因子，TOM和TN提供了Ca. J. asiatica生长的基本底物。因此，在饱和土壤，尽管Ca. B. anammoxidans丰度最高，但Ca. J.asiatica具有最大的厌氧氨氧化交互作用。
图3 高通量测序和生态网络分析厌氧氨氧化菌群落在全球含水层的环境机制分析。a 全球饱和土壤厌氧氨氧化结构分布。饼形图代表厌氧氨氧化群落多样性和组成。群落组成通过高通量测序hzsB基因分析（97% cut-off）和Neighbor-Joining方法构建。b LDA值分析样品种类区别。厌氧氨氧化群落结构和环境因子之间的相关关系分析。c亚表层饱和和不饱和土壤分子生态网络分析。节点代表OTU，节点颜色代表不同的厌氧氨氧化种类，节点间连接代表不同OTUs间交互作用。
5 厌氧氨氧化和其他氮循环过程交互作用分析
NO2-不仅是氮循环过程的重要中间产物，而且是厌氧氨氧化的关键底物，为进一步研究比较饱和土壤中厌氧氨氧化与其他氮循环过程的活性，采用15N同位素示踪技术检测一系列NO2-转化（厌氧氨氧化、反硝化、亚硝酸盐氧化、呼吸氨化）的速率潜势和NO2-生成（NH4+氧化和NO3-还原）的速率潜势（Fig. 4）。检测发现，饱和土壤中NH4+和NO2-产生和减少随着DO (溶解氧)量变化显著。当DO>0.5 mg L-1，氨氧化速率较高（53.16± 19.50 mmol N m−2 d−1, p < 0.05），为厌氧氨氧化和反硝化过程提供了主要的底物NO2- (84.6 ± 8.4%, p< 0.01)。呼吸氨化通常被认为仅发生于一些外围环境，而在这篇文章中，发现当氨氧化速率潜势较高时，呼吸氨化也发生了较高的速率潜势（10.78 ± 5.13 mmol N m−2 d−1, p < 0.05）。因此，呼吸氨化耦合氨氧化为厌氧氨氧化提供了大量可利用的NH4+底物。此外，呼吸氨化过程减少过量的亚硝酸盐，从而消除了毒性物质亚硝酸盐的抑制作用。与此相反，当DO<0.5 mg L-1, 氨氧化速率较低(1.01± 0.05 mmol N m−2 d−1, p < 0.05)，呼吸氨化速率也较低（0.56± 0.36 mmol N m−2 d−1, p < 0.01）。因此，在较为缺氧环境中，NO2–主要来自NO3-还原（95.9%以上）。相关性分析表明厌氧氨氧化速率潜势与氮流失（r = 0.935, p < 0.01）和反硝化（r= 0.801, p < 0.05）速率潜势呈正相关关系，与DO浓度呈负相关关系（r=- 0.612, p < 0.05）。综合以上数据，研究表明含水层厌氧氨氧化速率受DO浓度显著影响，并且厌氧氨氧化的生物地球化学机制和其他的氮循环过程不同，呼吸氨化是厌氧氨氧化的一个重要调控过程。
图4 饱和土壤中厌氧氨氧化速率最高时的生物地球化学机制。图中对应的饱和土壤样品采集地点分别是a 中国安新、b澳大利亚-昆士兰、c中国安图、d德国-不来梅（a-d：DO>0.5mg L-1）、e瑞士-苏黎世、f中国-武清（e-f：DO<0.5mg L-1）。黑线代表反硝化，红线代表厌氧氨氧化，紫线代表亚硝酸盐氧化，绿线代表呼吸氨化，这些过程解释了NO2-的减少。硝酸盐还原（蓝线）和氨氧化（粉线）被认为是产生NO2-的来源，呼吸氨化与厌氧氨氧化和反硝化竞争NO2-，提供给厌氧氨氧化NH4+,在厌氧氨氧化相关的氮循环过程中起重要的协调作用。所有速率潜势均是通过15N同位素示踪技术获得，数据均为平均值±s.e.（标准误差，n = 5）。
讨论
在海洋生态系统中，广泛发生的厌氧氨氧化分布对氮流失贡献显著，使人们重新认识了全球氮循环过程。然而报道的厌氧氨氧化细菌在陆地表层系统分布稀疏，仅限于不到全球9%面积的内陆水域和湿地土壤。因此，需要进一步调查全球陆地生态系统中厌氧氨氧化的分布。这篇研究证明了厌氧氨氧化在全球含水层广泛发生，厌氧氨氧化耦合硝化和呼吸氨化对氮流失和硝酸盐去除的显著影响。厌氧氨氧化-呼吸氨化耦合过程也被报道在海洋环境中，对氮流失有主要的作用。如在热带南太平洋东部和阿拉伯海，在NH4+离子浓度受限制环境下，呼吸氨化为厌氧氨氧化提供NH4+底物。在地下含水层系统中，厌氧氨氧化细菌需要的NH4+底物被呼吸氨化过程提供，相应的，高活性的氨氧化反应提供了呼吸氨化所需要的高浓度NO2-，呼吸氨化和氨氧化相互耦合发生，促进了厌氧氨氧化在全球含水层系统的广泛发生。
在含水层某些深度的饱和土壤发生的厌氧氨氧化对氮流失和NO3-去除的贡献超过了反硝化，厌氧氨氧化这种在空间上的差异归因于硝酸盐分布和地下水位情况。NO3-是继O2之后的第二个偏向于终端电子接受者。而且，硝酸盐与土壤一样呈负电荷，易于在土壤中淋失，从地表到地下浓度下降。祝贵兵研究组研究报道了水可以激活干旱土壤中厌氧氨氧化菌的活性，在土壤某些深度，厌氧氨氧化活性随着硝酸盐浓度增加而显著增加。当在更深层土壤中，硝酸盐浓度下降，这时饱和土壤的上部发生了显著的厌氧氨氧化，而且，测定的厌氧氨氧化活性区间随着地下水位改变而相应发生移动，厌氧氨氧化经常在饱和土壤的上部发生并达到活性高峰。
厌氧氨氧化和反硝化过程对硝酸盐去除贡献比例变化也归因于各反应细菌代谢途径的差异。反硝化细菌大多数是兼性异养，因此可从氧化有机化合物获得能量，使用有机碳作为电子供体。厌氧氨氧化由自养型细菌发生，能量由含氮化合物和二氧化碳提供。含水层含有可溶性有机物和有机碳比较少，一定程度上限制了反硝化过程，适合厌氧氨氧化的发生。厌氧氨氧化细菌与其他细菌相比，具有较低的底物半饱和系数（KS）。Candidatus Kuenenia NH4+ KS低于5μM，NO2− KS在0.2–0.3μM之间，Candidatus Brocadia NH4+的KS低于5μM，NO2−KS低于<5μM。这种特点使厌氧氨氧化细菌在底物竞争中具有选择性优势。氨氧化细菌Nitrospira sp. AV NH4+ 的KS是0.14mM，Nitrosomonas europaea NH4+的KS是1.9mM，亚硝酸盐氧化细菌Nitrospira NO2− 的KS是0.01mM，Nitrobacter NO2−的KS在0.02–0.14mM之间。厌氧氨氧化细菌的这种生理生化特征有助于在水生和陆地系统中广泛生长和发生作用。
尽管厌氧氨氧化和呼吸氨化通常被认为只有在无氧/缺氧群落交错带才能显著发生，但这两个过程可以出现在不同的氧浓度下。在过去几年中，几篇研究报道了在大于80%氧饱和的泥浆、完整土柱、水柱等环境样品中发生了呼吸氨化。作者曾研究报道了厌氧氨氧化广泛出现在好氧污水处理系统中（DO > 5 mg L-1）。此外，厌氧氨氧化和呼吸氨化可同时出现在湖泊岸边带和人工构建湿地的好氧隔层。研究表明Ca. Kuenenia（0–6.4 mg L-1）比Ca. B. fulgida (<0.032 mg L−1) 和Ca. B. anammoxidans (2.24 mg L−1)更适合高DO 环境。
在饱和土壤中，厌氧氨氧化的速率潜势和丰度分别高于0.5 nM N g−1h−1和105 copies g-1 土壤，然而在非饱和土壤中检测不到厌氧氨氧化的丰度和反应潜率。生物地理化学相关性分析实验表明底物NH4+和NO3-浓度和厌氧氨氧化的速率潜势有很少的正相关关系。因此底物可能不是厌氧氨氧化发生的限制因子，然而，含水量与厌氧氨氧化的发生有高度的正相关关系。作者曾研究报道，在陆地水环境系统中普遍存在着厌氧氨氧化，在水淹后的岸边带土壤中，检测到厌氧氨氧化的存在，在水淹前的岸边带土壤中未检测到厌氧氨氧化细菌。在陆地干旱土壤，尽管可以检测到厌氧氨氧化细菌基因，厌氧氨氧化反应活性迄今为止没有检测到。然而，当旱地土壤含水量大于29%时，厌氧氨氧化细菌丰度达到107 copies g−1，速率潜势达到0.46 ± 0.08 nmol Ng−1 h−1。祝贵兵研究组研究表明，水可以激活休眠的厌氧氨氧化细菌，因此，推测含水量是一个控制厌氧氨氧化开启的关键因子。
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