科研 | Gut microbiota：粪肠球菌产生的肉豆蔻酸通过活化棕色脂肪组织抑制肥胖（国人作品）
编译：逍遥君，编辑：小菌菌、江舜尧。
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膳食纤维对能量代谢有一定的促进作用，目前国内外研究主要集中在肠道菌群产生的短链脂肪酸上。人参有助于控制体重，但其作用机制尚不清楚。研究人员主要探讨人参对肠道菌群的潜在调节作用，旨在鉴定特定菌株及其代谢产物，特别是介导人参减肥作用的长链脂肪酸。为了找出相关菌株，研究人员以高脂饮食诱导的db/db肥胖小鼠为模型，灌胃人参提取物，并用16S rDNA高通量测序法评价人参提取物对肠道菌群的影响。为了确定候选脂肪酸，研究人员对血清和培养基样品进行了非靶向代谢组学分析。结果表明人参提取物可诱导粪肠球菌产生不饱和长链脂肪酸，即肉豆蔻油酸；粪肠球菌及其代谢产物肉豆蔻油酸可通过激活棕色脂肪组织活性和米色脂肪的形成来抑制肥胖；粪肠球菌编码酰基辅酶A硫酯酶的基因表现出合成肉豆蔻油酸的潜力，CRISPR-dCas9敲除酰基辅酶A硫酯酶基因可显著降低肉豆蔻油酸的产量；此外，外源性基因敲除粪肠球菌不能复制野生型粪肠球菌的有益效果，而野生型粪肠球菌是通过增加肉豆蔻油酸水平而达到抑制肥胖的效果；最终探究出肠道菌群-长链脂肪酸-棕色脂肪组织轴在宿主代谢中起重要作用。该研究为下一代减肥药的开发提供了战略优势。
论文ID
原名：Myristoleic acid produced by enterococci reduces obesity through brown adipose tissue activation
译名：粪肠球菌产生的肉豆蔻酸通过活化棕色脂肪组织抑制肥胖
期刊：Gut
IF：19.819
发表时间：2020.6
通讯作者：金万洙&李东浩
作者单位：中国科学院动物研究所动物生态与保护生物学重点实验室&长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室
实验设计
结果
1 人参提取物通过激活棕色脂肪组织降低肥胖，促进能量代谢
本研究通过肠道菌群和棕色脂肪组织探讨人参提取物对肥胖的影响。给db/db小鼠灌胃给予人参提取物（10 mg/kg）。8周后，人参提取物处理组的体重增长明显减少（图1A）。CT检测的结果与体重变化一致，与对照组小鼠相比，全身脂肪的百分比减少了11%（图1B）。此外，经人参提取物治疗后，与对照组小鼠相比，附睾脂肪重量显著降低，而棕色脂肪、皮下脂肪和肝脏的重量没有明显变化（图1C）。这些结果表明，人参提取物能显著降低db/db小鼠的体重和肥胖率。由于肥胖往往伴随着能量平衡的改变，因此，本研究采用间接量热法（TSE）检测了人参提取物对小鼠代谢的影响。与对照组小鼠相比，人参提取物显著增加了能量消耗（图1D），而在食物摄入、能量摄入（在线补充图1A,D）、体力活动（在线补充图1B）、两组间呼吸交换率（RER）（在线补充图1C）、吸收能量（在线补充图1E）和消耗能量（在线补充图1F）方面均没有显著差异。结果表明，人参提取物的减肥作用是由于增加了能量消耗，而不是减少了食物摄入或增加了体力活动。此外，当动物暴露于寒冷环境（4℃，4小时）时，人参提取物处理大大提高了核心体温（图1E,F）。更重要的是，人参提取物治疗改善了葡萄糖同质化（在线补充图1G）和胰岛素敏感性（在线补充图1H），并减少了肝脏脂肪变性（在线补充图1I-K）。这些结果表明，人参提取物能改善肥胖小鼠的能量均一性。这可以部分解释为棕色脂肪组织产热活性的提高（图1G）和解偶联蛋白1表达增加，解偶联蛋白1通过解偶联过程产生热量，并在人参提取物处理的db/db小鼠的棕色脂肪和皮下脂肪中表达氧化磷酸化（图1H，I）。棕色脂肪组织是一种产热器官，对维持核心体温至关重要，其产热活性在热中性条件下受到抑制。然而，人参提取物治疗不影响热中性条件下的体重增加（在线补充图1L）。这一结果证明了人参提取物的减肥作用与棕色脂肪组织的活性有关。总而言之，上述结果表明，人参提取物通过激活棕色脂肪组织促进全身能量代谢，而不改变能量摄入或体力活动。
图1 人参提取物增加db/db小鼠的全身能量代谢和棕色脂肪组织活性。db/db小鼠每日经口灌胃给予人参提取物（10 mg/kg）8周（n=7-8）。（A-C）人参提取物处理显著降低了db/db小鼠的体重增长和附睾脂肪重量。（D-F）db/db小鼠经人参提取物治疗后，能量消耗和核心体温显著升高。（G-I）人参提取物处理显著增加了db/db小鼠棕色脂肪组织和皮下脂肪组织中解偶联蛋白1和线粒体氧化磷酸化蛋白的表达。
2 人参提取物的摄入可富集粪肠球菌（E. faecalis）
人参皂苷可以通过肠道微生物群的作用而去糖基化已被证明。因此，我们研究肠道微生物群是否能通过去糖基化在人参提取物处理的小鼠中发挥关键的减肥作用。基于这个设想，通过16S rDNA基因扩增子测序检测粪便样品的细菌群落多样性。人参提取物处理组细菌群落α-多样性值（ACE、Chao 1、Shannon和Simpson指数）显著低于对照组小鼠（在线补充表1）。通过主成分分析研究肠道微生物群的总体结构，表明这两组动物肠道微生物群结构明显不同（图2A）。门级比例丰度，尤其是厚壁菌和拟杆菌，在人参提取物处理后没有表现出显著差异（在线补充图2A）。这可能是由于16S rDNA基因扩增子测序不能覆盖100%的肠道微生物群。除此之外，db/db小鼠中有35个OTU被人参提取物显著改变（在线补充图2B）。并且，我们发现粪肠球菌在科属种水平上均显著富集（图2B-D）。因此，我们的结果表明，肠道微生物群的组成随着人参提取物处理而发生显著变化，其中粪肠球菌大量富集（图2E）。
图2 人参提取物改变了db/db小鼠的微生物群组成。db/db小鼠每日经口灌胃给予人参提取物（10 mg/kg）8周（n=8）。（A）基于UniFrac算法的加权主成分分析。（B-D）通过焦磷酸测序分析比较两组粪便中粪肠球菌科、属和种水平的相对丰度。（E）LEfSe测定两组间的区别类群（log10 LDA>3.5）。
3 粪肠球菌（E. faecalis）给药可抑制肥胖
粪肠球菌是一种革兰氏阳性细菌，属于乳杆菌目。粪肠球菌是健康人体胃肠道常见的共生菌，也是医院获得性感染的主要原因。为了探讨粪肠球菌在肥胖中的作用，我们以高脂饮食喂养的小鼠为模型。有趣的是，我们发现用粪肠球菌治疗的小鼠的体重和脂肪量都显著减少（图3A,B）。进而我们检查了粪肠球菌治疗是否会影响能量代谢。值得注意的是，当动物暴露于寒冷环境（4℃，4小时）时，粪肠球菌处理显著提高了核心体温（图3C,D）。此外，与对照组相比，粪肠球菌处理的小鼠的能量消耗显著增加（图3E）。组织学分析结果于此一致，粪便大肠杆菌处理的小鼠棕色脂肪组织中的脂滴大小远远小于对照小鼠（图3F）。相应地，粪肠球菌处理的小鼠的棕色脂肪组织和亚脂肪组织中解偶联蛋白1和氧化磷酸化蛋白的表达显著上调（图3G,H）。此外，粪肠球菌治疗改善了葡萄糖的同质化，减少了肝脏脂肪变性（在线补充图3D-H）。这些有益影响与食物摄入量、体力活动或呼吸交换率的差异无显著相关性（在线补充图3A-C）。重要的是，粪肠球菌治疗不影响热中性条件下的小鼠体重（在线补充图3I）。因此，上述结果有力地表明，粪肠球菌通过激活棕色脂肪组织和米色脂肪的形成，增加了能量消耗，抑制肥胖。
图3 粪肠球菌增加高脂饮食喂养小鼠的全身能量代谢和棕色脂肪组织活性。高脂饮食小鼠灌胃粪肠球菌（1×1010 CFU）8周（n=7-9）。（A-B）粪肠球菌治疗显著降低了高脂饮食喂养小鼠的体重增加和脂肪质量。（C-E）粪肠球菌治疗后，高脂饮食喂养小鼠的核心体温和能量消耗显著增加。（F-H）粪肠球菌处理显著增加了高脂饮食喂养小鼠棕色脂肪组织和皮下脂肪中解偶联蛋白1和线粒体氧化磷酸化蛋白的表达。
4 血清代谢物中肉豆蔻油酸的富集可抑制肥胖
粪肠球菌影响宿主能量代谢的一个潜在机制是通过肠道微生物发酵产生的次级代谢产物。已表明解偶联蛋白1可被长链脂肪酸激活。据报道，长链脂肪酸作为底物永久性地附着在解偶联蛋白1上，促进H+从线粒体内膜到外膜的转移。因此，了解粪肠球菌治疗是否会改变血清长链脂肪酸的含量是很有意义的。因此，我们对血清样本中的长链脂肪酸进行了非靶向代谢组学分析。结果表明，口服粪肠球菌可显著改变多种长链脂肪酸的含量（图4A）。为了确定哪些长链脂肪酸在粪肠球菌治疗后发生了特异性改变，我们进一步分析了有无粪肠球菌的培养基中长链脂肪酸的含量。我们发现，有粪肠球菌的培养基中含有更高水平的肉豆蔻油酸（C14:1），最大值是未经处理的12.3倍（图4B）。此外，非腺苷甲酸（C19:0）和亚油酸（C18:2）也显示出一定程度的显著富集（分别是未经处理的5.9和4.3倍），而其他长链脂肪酸的差异程度较小（图4B）。这些结果有力地表明粪肠球菌可能参与脂肪酸代谢。为了进一步研究长链脂肪酸对棕色脂肪组织活性的潜在影响，我们用不同的长链脂肪酸处理原代棕色脂肪细胞，并测定细胞耗氧量。细胞实验的结果表明，肉豆蔻油酸显著上调了耗氧量（图4C）。然而，其他包括亚油酸在内的脂肪酸没有表现出这种影响（在线补充图4A）。此外，肉豆蔻油酸显著增加解偶联蛋白1的表达（在线补充图4B）。这些结果暗示肉豆蔻油酸可能会增强棕色脂肪组织的活性。为了进一步阐明这个假设，我们使用了被荧光素酶活性（反应内源性解偶联蛋白1表达）标记的基因改造小鼠。肉豆蔻油酸处理后，荧光素酶活性显著增加（在线补充图4C,D）。表明了肉豆蔻油酸处理对肥胖肥胖具有潜在疗效。为了验证这一假设，db/db小鼠灌胃给予肉豆蔻油酸。结果与预期相同，肉豆蔻油酸通过增加棕色脂肪组织产热和全身能量代谢（图4F,G，在线补充图4F）显著降低体重增加（图4D）和肥胖（图4E，在线补充图4E）。此外，我们发现肉豆蔻油酸可激活棕色脂肪组织活性（图4H,I），诱导米色脂肪形成（图4J），并逆转肝脏脂肪变性（在线补充图4J-K）。这些有益影响与食物摄入、体力活动或呼吸交换率（在线补充图4G–I）的变化没有显著相关性。为了评估肉豆蔻油酸激活棕色脂肪组织是否可用来解释人参提取物的减肥机制，我们使用UCP1-KO小鼠（该小鼠棕色脂肪组织活性大大降低），来进一步验证我们的结果。结果表明，肉豆蔻油酸可减轻高脂饲养的野生型小鼠体重，但对无法减轻UCP1 KO小鼠的体重（在线补充图5A-C）；可增加高脂饲养的野生型小鼠的棕色脂肪组织产热、改善葡萄糖均相稳态（由于体温过低，UCP1 KO小鼠未进行冷激发实验）（在线补充图5D-G）；可增加高脂饲养的野生型小鼠的能量消耗，但UCP1 KO小鼠没有增加（在线补充图5H）；可改善高脂饲养的野生型小鼠的棕色脂肪组织肥大、逆转脂肪肝变性，但对UCP1 KO小鼠则无此作用（在线补充图5K,L,O,P）；高脂饲养的野生型小鼠的在肉豆蔻油酸治疗后，棕色脂肪组织和皮下脂肪组织中解偶联蛋白1表达显著上调（在线补充图5M-N）；这些有益的影响不是由食物摄入或体力活动所介导的（在线补充图5I-J），并且肉豆蔻油酸治疗不影响热中性条件下的体重增加（在线补充图5Q）。综上所述，粪肠球菌产生的肉豆蔻油酸可通过增强棕色脂肪组织活性和全身代谢来抑制肥胖。
图4 肉豆蔻油酸给药可降低肥胖。（A）粪肠球菌治疗可改变高脂饮食喂养小鼠血清内长链脂肪酸的含量（n=9）。（B）粪肠球菌增加MRS培养基中肉豆蔻油酸的水平（n=6）。（C）用10 μM肉豆蔻油酸或牛血清蛋白处理棕色脂肪形成的第6天的耗氧量（n=5-6）。为了研究肉豆蔻油酸对全身能量代谢的潜在影响，db/db小鼠每日灌胃给予肉豆蔻油酸（5 mg/kg）8周（n=7-10）。（D–E）肉豆蔻油酸处理显著降低了db/db小鼠的体重和脂肪含量。（F–G）db/db小鼠经肉豆蔻油酸治疗后，核心体温和能量消耗显著增加。（H）db/db小鼠棕色脂肪组织H&E染色。（I–J）肉豆蔻油酸处理显著增加了db/db小鼠棕色脂肪组织和皮下脂肪组织中解偶联蛋白1和线粒体氧化磷酸化蛋白的表达。
5 粪肠球菌产肉豆蔻油酸含量的降低抑制其抗肥胖效果
ACOTs是催化羰基和硫原子之间的硫酯键水解，产生脂肪酸和辅酶a的一个大的酶家族（图5A）。在人体中，1-硫酯酶水解一系列脂肪酰辅酶a，偏好长链酰基辅酶a分子，二聚反应由脂肪酰辅酶a诱导。为了阐明粪肠球菌是如何产生肉豆蔻油酸的，我们首先利用CRISPR-dCas9技术成功地建立了酰基辅酶A硫酯酶基因敲除菌株和野生型粪肠球菌菌株（与野生型相比，基因敲除菌株约为60%）（图5B）。酰基辅酶A硫酯酶基因的敲除没有改变粪肠球菌的生长（数据未显示）。接下来，将两种粪肠球菌菌株培养在MRS培养基中，并对长链脂肪酸进行非靶向代谢组学分析。野生型菌株能够诱导肉豆蔻油酸的积累，而基因敲除菌株不能诱导肉豆蔻油酸的积累（图5C）；与野生粪肠球菌相比，敲除基因并未显著改变其他的长链脂肪酸和短链脂肪酸的含量（在线补充图6A）。这些结果清楚地表明，肉豆蔻油酸的产生至少部分是由酰基辅酶A硫酯酶介导的。为了研究转基因粪肠球菌菌株对解偶联蛋白1活性的影响，我们采用了多种小鼠模型。野生型粪肠球菌（而非基因敲除粪肠球菌）可降低高脂喂养小鼠的肥胖率（图5D，E，在线补充图6B）；野生型（而非基因敲除）粪肠球菌能够增加冷诱导的产热（图5G，在线补充图6C）和能量消耗（图5F），而食物摄入量没有显著变化（在线补充图6D）。在解偶联蛋白1荧光素酶转基因小鼠模型中，野生型菌株的内源性解偶联蛋白1活性也显著上调，但在基因敲除粪肠球菌处理下，解偶联蛋白1活性没有显著上调（图5H，I）。为了避免肠道菌群之间的种间串扰，用广谱抗生素对小鼠进行预处理。野生型菌株可以增强棕色脂肪组织活性和冷诱导的产热，而基因敲除菌株处理的db/db小鼠不能（在线补充图6E-F）。这些结果清楚地证明了酰基辅酶A硫酯酶基因在肉豆蔻油酸生物合成中的重要作用。综上所述，我们发现粪肠球菌通过酰基辅酶A硫酯酶基因驱动肉豆蔻油酸的产生。
图5 粪肠球菌酰基辅酶A硫酯酶是参与肉豆蔻油酸合成的关键酶。（A）酰基辅酶A硫酯酶合成游离脂肪酸的途径。（B）用CRISPR-dCas9技术成功地敲除粪肠球菌株的酰基辅酶A硫酯酶基因（n=4-5）。（C）MRS培养基中野生型和基因敲除粪肠球菌菌株对长链脂肪酸生物合成的影响（n=4）。高脂喂养的小鼠每天灌胃野生型和基因敲除菌株（1×1010CFU）5周（n=6-8）。（D–E）高脂喂养的小鼠通过野生型菌株灌胃处理后，体重和脂肪质量显著降低，而基因敲除菌株处理组则没有变化。（F-G）高脂喂养的小鼠通过野生型菌株灌胃处理后，能量消耗和核心体温显著升高，而基因敲除菌株处理后则无明显变化。（H-I）高脂喂养的小鼠通过野生型菌株灌胃处理后，内源性解偶联蛋白1活性显著降低，而基因敲除菌株处理后则无明显变化。（n=5）。（J）人参提取物通过富集肠道中粪肠球菌的丰度，进而通过酰基辅酶A硫酯酶基因产生长链脂肪酸（肉豆蔻油酸），并通过增强棕色脂肪组织活性和米色脂肪的形成进一步抑制高脂诱导的肥胖。
讨论
虽然人参作为一种中药，具有包括抗肥胖和肥胖相关疾病在内的多种生物学功能，但其分子机制尚不清楚。在这项研究中，通过整合肠道微生物组、血清代谢组和棕色脂肪组织的数据，我们证明了人参提取物-粪肠球菌-长链脂肪酸（特别是肉豆蔻油酸）轴通过增加棕色脂肪组织活性和米色脂肪形成来减少肥胖。此外，粪肠球菌通过酰基辅酶A硫酯酶驱动肉豆蔻油酸的产生。此外，我们在这项研究中首次证明，作为一种长链脂肪酸，粪肠球菌产生的肉豆蔻油酸在治疗代谢综合征疾病（如肥胖症）方面具有巨大潜力（图5J）。
肥胖是一种慢性疾病，它的诱因众多，包括遗传因素、生活方式、饮食、肠道微生物群和能量代谢失衡。因此，以增加能量消耗为目标的药物有可能成为最有效、最具吸引力的减肥策略。棕色脂肪组织作为一种能量消耗器官，备受关注。因而，增加棕色脂肪组织或其活性是治疗肥胖症和代谢性疾病的一种充满潜力的策略。事实上，我们小组和其他人的研究表明，移植棕色脂肪组织或使用能够激活棕色脂肪组织的芦丁均可以逆转各种肥胖模型小鼠的代谢紊乱。
最近,数个报告已经指出棕色脂肪组织和肠道菌群之间的相互作用。这些结果表明，人参提取物介导的棕色脂肪活化可能与肠道菌群的变化有关。此外，人参提取物还可以改变肠道菌群组成。我们还发现，经过人参提取物处理后，粪肠球菌在科属种水平上均显著富集。此外，我们发现粪肠球菌可以通过增强棕色脂肪组织的活性和米色脂肪的形成来显著减少肥胖。有趣的是，以前的研究表明热处理的粪肠球菌（细菌在110℃下加热10分钟）具有减肥作用，并改善了DIO小鼠的肝脏脂肪变性。一项研究报告说，高压灭菌可消除活的阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）的减肥作用。尽管缺乏对粪便热处理的分子机制的认识，但仍可推测粪肠球菌在高温灭菌后会丧失其生物活性。
为了探究其作用机制，我们推测人参提取物发酵过程中产生的次生代谢物可能在棕色脂肪组织活化中起重要作用。有报告显示，大鼠虽采食相同，但经短链脂肪酸（如丙酸盐和丁酸盐）处理的大鼠体重增长明显低于未经处理组。然而，其他的研究表明醋酸盐可通过微生物-脑-β-细胞轴促进代谢综合征。本研究发现，粪肠球菌治疗后，短链脂肪酸无显著差异，但长链脂肪酸（肉豆蔻油酸）的产量显著增加。此外，脂肪酸19:0和18:2在粪肠球菌处理后在一定程度上也增加（图4B）。最近有研究表明，长链脂肪酸作为底物永久性地附着在解偶联蛋白1上，有助于通过解偶联蛋白1携带H+。耗氧量实验结果表明，与C14:1相比，C19:0和C18:2的影响较小（在线补充图4A）。这些结果有力地证明粪肠球菌可诱导肉豆蔻油酸水平，进而涉及解偶联蛋白1介导的产热。分子分析表明，编码酰基辅酶A硫酯酶基因的粪肠球菌参与了肉豆蔻油酸的生物合成，该基因的缺失，不能降低高脂喂养小鼠的体重。然而，关于有利于肉豆蔻油酸产生的底物类型（如短链脂肪酸或碳水化合物）的数据在很大程度上仍然是未知的。此外，我们的研究不排除人参减肥作用的其他可能机制，包括通过调节血管生成减少脂肪细胞肥大、通过刺激一磷酸腺苷活化激酶途径增加能量消耗、减少脂肪生成和炎症和维持肠道屏障的完整性。
总之，通过整合肠道微生物组、血清代谢组和棕色脂肪组织的数据，我们证明了人参提取物–粪肠球菌–长链脂肪酸（特别是肉豆蔻油酸）轴通过增强棕色脂肪组织活性和米色脂肪形成来减少肥胖。此外，我们观察到粪肠球菌通过酰基辅酶A硫酯酶基因驱动肉豆蔻油酸的产生。此外，我们首次证明，粪肠球菌产生的肉豆蔻油酸（一种长链脂肪酸）在治疗代谢综合征疾病（如肥胖）方面具有巨大潜力。
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