作者解读 | Microb Cell Fact：“芳香四溢”的秘密—亚热带海洋红树林湿地微生物GXDK6的产香机制

编译：微科盟莫名其妙，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

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导读

橙花醇（C ₁₀ H₁₈ O），天然存在于植物精油中的香味物质，广泛应用于食品，化妆品和药品等，还是食品防腐的潜在的抗真菌剂。全球每年对橙花醇的需求量超过5,000吨，但全球橙花醇的生产能力仅为3,000吨左右。目前，化学合成是大规模生产橙花醇的唯一策略，但是化学合成的缺点极大地限制了橙花醇的生产和应用，然而限制环保的生物合成法生产橙花醇的主要技术瓶颈是，缺乏相应的天然产生香气的微生物。在这项研究中，通过全基因组测序和代谢组学分析技术鉴定了一种来自于亚热带海洋红树林湿地具有产香功能的且具备多重抗性的益生菌Meyerozyma guilliermondii GXDK6。GXDK6在酸碱（pH 2.5~10.0）条件下，盐碱（0~12% NaCl，0~18% KCl/MgCl₂）条件下或重金属（Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺等）条件下都显示出极强的耐受性能。同时还可以发酵总共21种单一有机物，并产生丰富的芳香代谢产物。气相色谱-质谱法的结果表明，当GXDK6用葡萄糖，蔗糖，果糖和木糖发酵72 h时，会产生8-14种芳香族类代谢产物（异戊醇，神经醇，香叶醇，苯乙醇，异丁醇等）。其中，橙花醇是GXDK6发酵产生的新型芳香族代谢产物，其生物合成机理也得到了进一步揭示。这些发现表明，具有多重耐受性的产生香气的GXDK6在发酵工业中具有巨大的潜在价值。该研究显示了天然的橙花醇生物合成的新策略，也为工业生产香气物质提供了新的生物材料和理论参考。

论文ID

原名：Whole genomesequencing and metabolomics analyses reveal the biosynthesis of nerol in amulti-stress-tolerant Meyerozyma guilliermondii GXDK6

译名：全基因组测序和代谢组学分析揭示了具备多重抗性Meyerozymaguilliermondii GXDK6生物合成橙花醇的分子机制

期刊：Microbial Cell Factories

IF：4.187

发表时间：2021.1

通讯作者：蒋承建

通讯作者单位：广西大学生命科学与技术学院

实验设计

该研究以亚热带红树林沉积物中分离出的天然酵母菌为研究对象。通过全基因组测序和代谢组学技术成功鉴定出一种新型的产香微生物——Meyerozyma guilliermondii GXDK6，并揭示了GXDK6中香味物质橙花醇生成的分子机制。首先通过平板培养法和扫描电子显微镜技术对菌落特征和细胞形态进行分析，并对pH 2.5-10.0范围耐受性，NaCl，KCl和MgCl₂在0%–18％耐盐性， Cd ²⁺，Cu ²⁺，Mn ²⁺，Co ²⁺，Ni ²⁺，Cr ²⁺和Zn ²⁺7种重金属耐受性，25–50℃的温度敏感性等多重抗性进行了研究。通过进行全基因组测序，采用在线软件FastQC，BUSCO，和Hmmscan等分析全基因组数据，使用ITS序列完成GXDK6的分子生物学鉴定。

为探索GXDK6发酵单一有机物的能力，使用总共21种单一有机物（葡萄糖，蔗糖，果糖，木糖，木聚糖，山梨糖醇，棉子糖，甘露糖，海藻糖，纤维素，麦芽糖，阿拉伯糖，菊粉，甘露醇，山梨糖，D-半乳糖，纤维二糖，小麦麸，乙醇，琥珀酸和L-鼠李糖等），在旋转摇床上以200 rpm，30 ℃进行了48 h的实验。采用气相色谱质谱联用技术（GC-MS）检测将GXDK6在含有葡萄糖，蔗糖，果糖和木糖作为唯一碳源的发酵体系中孵育72 h的代谢产物，并分析其芳香族代谢物，通过KEGG数据库（https://www.kegg.jp/kegg/genes.html）注释GXDK6的基因组数据中与芳香族代谢物有关的基因，揭示其生物合成机理。

结果

1 GXDK6的理化特性和多重抗性性能结果

GXDK6的菌落为乳白色，圆形，凸起和光滑（图1a），细胞大小在2-12μm之间，细胞形态为椭圆形或半椭圆形，表面光滑（图1b）。GXDK6可以在pH 2.5 10.0范围生长，对酸和碱环境具有较强的抗性，尤其是对酸性环境（图1c）。除此之外，GXDK6还是一种对高盐浓度具有耐受性的益生菌，可以在高达12％ NaCl，18％ KCl和MgCl₂条件下生长良好（图1d）。同时，还显示出对7种重金属（即Cd ²⁺，Cu ²⁺，Mn ²⁺，Co ²⁺，Ni ²⁺，Cr ²⁺和Zn ²⁺）的良好耐受性（图1e）。Ni ²⁺的最大耐受浓度为5.8 ppm，而Mn ²⁺为5494 ppm。该特征显示了该物种在重金属环境中具有除臭和生物修复的潜力。GXDK6可以在25–45℃温度范围内生长，最适生长温度为30–37℃（图1f）。

图1 Meyerozyma guilliermondii GXDK6的理化特性

a: 菌落特征；b：在扫描电子显微镜下观察到的GXDK6的形态；c：GXDK6在pH 2.5-10.0的范围内的相对生物量；d：盐浓度逐渐增加时，GXDK6的相对生物量；e ：GXDK6在不同重金属下的相对生物量；f：GXDK6在25–50 °C的温度范围内的相对生物量。

2 GXDK6全基因组测序分析

GXDK6的reads为8, 319, 572条，总碱基为2, 477, 073, 673 bps，其中GC含量占38.88％（其他文件1）。模糊基数仅为0.001％，Q 20％为94.60％，Q 30％为86.73％。GXDK6的基因组约为15,000 bps。结果表明提取的DNA是一条清晰的单条带，可以进行后续分析（图2a）。然后，构建了测序结果的单碱基质量分布图（图 2b）。过滤数据的平均质量也很可靠（图2c）。第三代测序数据的平均质量分布良好(图 2d)，该序列可用于后续的基因剪接。ITS结构域分析表明，GXDK6为与Meyerozyma sp.具有较高的一致性（图2e）。结合上述研究，进一步确认GXDK6并命名为Meyerozyma guilliermondii GXDK6。

图2 Meyerozyma guilliermondii的鉴定和全基因组测序分析

a：毕赤酵母菌株的基因组DNA验证图；b: 毕赤酵母菌株在所有碱基上的质量得分；c: 第三代测序数据的序列长度分布；d: 毕赤酵母菌株的剪接的基因组信息；e: 毕赤酵母菌株的系统发育树

3 单有机物发酵能力，产香特性和橙花醇生物合成机制分析

GXDK6利用单有机物发酵能力的顺序为：山梨糖醇>木聚糖>棉子糖>甘露糖>蔗糖>果糖>海藻糖>菊粉>麦芽糖>阿拉伯糖>甘露醇>葡萄糖>山梨糖> D-半乳糖>纤维二糖>木糖>纤维素>乙醇>小麦麸皮>琥珀酸> L-鼠李糖（图3a）。该结果表明GXDK6具有利用戊糖和己糖的强大能力。用GC-MS方法检测了由GXDK6以葡萄糖，蔗糖，果糖和木糖为唯一碳源(图3b)产生的代谢物分别为14、20、16和26种（图3cdef），可分类为醇，酯，酸，烃，醛，酮，硫化物，酚类和其他有机物质（图5a）。醇，脂质和有机酸通常被定义为主要的芳香族代谢产物。GXDK6发酵葡萄糖和蔗糖产生的主要芳香代谢物分别为9种和13种，果糖和木糖发酵产生的芳香族代谢物分别为8种和14种（图4b）。异戊醇，橙花醇，苯乙醇，甲酸和丙酸是这四种碳源发酵的共同代谢产物，且橙花醇含量排名前5。为什么GXDK6可以产生并保持长期的香气。因此，橙花醇的生物合成机理将有助于更好地理解GXDK6的香气产生机理。为了进一步研究GXDK6发酵产生香气的分子机制，以橙花醇为代表进行Meyerozyma guilliermondii的新型芳香代谢产物代谢途径阐述（图5a），香叶基二磷酸酶（图5b）；单萜二磷酸酶（图5c）；香叶醇异构酶（图5d）；香叶醇8-羟化酶（图5e）；醇脱氢酶（图5f）；香叶醇脱氢酶（图5g），并分析其相关的6种蛋白质的结构和功能。

图3 GXDK6发酵有机质的能力

A：在不同的单碳源培养下，Meyerozyma guilliermondii GXDK6的相对生物量；b：GXDK6分别以木糖，L-阿拉伯糖，葡萄糖和蔗糖作为单一碳源的生长曲线；c：以葡萄糖为唯一碳源的GXDK6的代谢物峰图；d：以蔗糖为唯一碳源的GXDK6的代谢物峰图；e：以果糖为唯一碳源的GXDK6的代谢物峰图；f：以木糖为唯一碳源的GXDK6的代谢物峰图。

图4 GXDK6发酵不同碳源的代谢组学分析

a：代谢物的分类；b：韦恩图分析芳香族代谢物；c：用葡萄糖发酵的GXDK6的前5种芳香族代谢物；d：用蔗糖发酵的GXDK6的前5种芳香族代谢物；e：用果糖发酵的GXDK6的前5种芳香族代谢物；f：用木糖发酵的GXDK6的前5种芳香族代谢物。

图5 GXDK6中橙花醇的代谢途径及其相关调节蛋白

a: 橙花醇的代谢途径；b：香叶基二磷酸酶；c：单萜二磷酸酶；d：香叶醇异构酶；e：香叶醇8-羟化酶；f：醇脱氢酶；g：香叶醇脱氢酶。

讨论

在这里，我们通过全基因组测序和代谢组学技术成功鉴定出一种新型的产生香气的Meyerozyma guilliermondii GXDK6。GXDK6在酸碱，盐碱和重金属环境下显示出高耐多应力性能。此外，GXDK6可以以21种有机物（包括戊糖和己糖）作为唯一碳源进行发酵，并且可以产生丰富的芳香代谢产物，例如醇，酯，酸等。GXDK6中芳香代谢产物橙花醇的产生机理也已经被揭示。这些结果表明，Meyerozyma guilliermondii GXDK6在发酵工业中具有巨大的潜在价值。

评论

产香益生菌对宿主和生态平衡非常有益。在过去的几十年中，众所周知酵母，乳杆菌和枯草芽孢杆菌是产香益生菌。这些菌株可通过自身的代谢规律产生大量有益的代谢产物，具有极高的实际应用价值。然而，大多数益生菌存在于特定的环境中，导致不同益生菌产生的香气物质之间存在种间差异。迄今为止，已知的产生香气的益生菌通常是条件依赖性微生物。由于某些不利于生长的条件，例如碳水化合物的酸化，大多数益生菌无法长时间发酵。能发酵不同的底物和在特殊环境下（例如，高盐，极其强碱性或强酸性条件）产生芳香代谢物，并维持和延长香气生产的产香益生菌的筛选变得越来越紧迫。Meyerozyma guilliermondii，在最近几年被广泛用于发酵食品生产风味化合物，据作者所知，Meyerozyma guilliermondii GXDK6是第一株来自亚热带海洋红树林沉积物的具有多重抗性的益生菌。这项研究显示了天然的橙花醇生物合成的新策略，也为工业生产香气物质提供了新的生物材料和理论依据。

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