Point mutation小鼠模型测序结果示意图

某些疾病由单个碱基突变引起，通过突变小鼠的相应碱基可以模拟。CRISPR 打断 DNA 的同时，提供含有目的突变的单链修复模板，能够有效地建立点突变小鼠。影响点突变效率的主要因素是，该点突变附近有没有高效率切割 DNA 的 gRNA，如果有，是比较幸运的，如果没有，可以选取邻近的 gRNA，这可能造成二次切割，需要引入同义突变。在这里提醒大家，切割位点离突变位点越远，突变效率越低。

如下图所示，图A为野生型小鼠PCR 产物测序峰图。图B为阳性F0 代小鼠基因型鉴定PCR 产物测序峰图。CRISPR/Cas9 作用后，由于发生同源重组修复(HR) 的同时，也可能发生非同源重组修复(NHEJ)。因此，切点附件可能出现杂峰。图C为阳性F1 代小鼠基因型鉴定PCR产物测序峰图。阳性F1 小鼠基因组一个拷贝是野生型，一个拷贝是突变体，在Cas9 作用位点附近区域测序，突变点位置有双峰现象（野生型和突变体，两种基因型产生了两种峰型）。图C’ 和图C” 为图C中测序PCR 产物链接T-vector 后，单克隆测序结果。其中，C’为野生型，C” 为突变体。峰型对比可以发现C” 较C’ 的目的突变点CCT 突变为GTT，C’ 和C” 峰型结果可以和C 图峰型结果相吻合。