使各种材料表面具有生理活性 - -人工合成的粘附性生长因子
化学研究所(理研)创发物性科学研究中心创发生物工程材料研究小组的多田诚一研究员、伊藤嘉浩小组组长(开拓研究总部伊藤纳米医学工程研究室主任研究员)和东京工业大学生命理工学院生命理工系的小畠英理教授等组成的联合研究小组，分析了贝壳分泌的水中粘合蛋白质中含有的翻译后修饰氨基酸[1] 开发了含有的人工合成多肽[2] (粘着性生长因子)，将其粘着在各种材料上，从而可以控制细胞功能。本研究成果可望在今后开发更适合再生医疗基质和生物体内环境的人工内脏器官等医疗材料方面做出贡献。伊藤浩小组组长等人利用贝类在水中也与岩石相连的原理，通过基因重组技术和酶法开发了可与无机材料相连的蛋白质。这次，联合研究小组进一步发展了以往的技术，利用完全人工的固相合成法[3]，成功地在各种材料中制备出了2种粘接性能够控制细胞功能的多肽。 这些新的多肽一旦溶解在弱碱性的水溶液中，再处理成普通的固体表面，无论有机还是无机材料，都会牢固地结合在表面上。 并且发现，处理后的材料都有促进细胞增殖和诱导分化的效果，这些效果比只有生长因子以溶液状态存在时要高。本研究成果将刊登在科学杂志《高级科学》在线版( 6月28日)上。
背景在现代医疗中，各种各样的材料在体内作为人工脏器或医疗器械的一部分，与体内和生物体成分接触被使用。 例如人工骨、人工关节、牙科植入体使用金属和陶瓷等坚硬的无机材料，眼内镜片、人工血管、透析模块使用塑料等有机材料等，种类广泛的材料被活用。 这些被选为医疗用材料的材料是考虑到生物相容性而选择的，但与生物体的粘接性和移植后的生存性不充分，一直在探索通过材料表面的处理来提高这些性质的方法。为了提高生物材料的生物亲和性，经常使用将具有生理活性的蛋白质固定在材料表面的方法。 迄今为止，伊藤浩小组组长等人发现，紫贻贝[4]等贝类在岩石上粘合时分泌的粘合性蛋白质的含有成分，将具有粘合活性的3，4 -二羟基苯丙氨酸( DOPA ) [5]作为生长因子蛋白质的一种这次，我们发展了以往的技术，挑战了合成具有完全人工导入DOPA的细胞生长因子氨基酸序列的全长多肽。注1 ) 2016年7月11日新闻发布会“能够活化细胞的钛”
研究方法和成果在无机或有机材料的表面固定被称为生长因子的蛋白质，可以赋予材料细胞生长促进活性，因此迄今为止也用各种各样的固定化方法开发了各种各样的生长因子蛋白质。 但是，有必要每次都研究适合材料种类的固定化方法。因此，联合研究小组开发了不依赖于材料，且可以通过简单的处理固定化的成为生长因子的多肽。 利用只通过化学反应依次连接氨基酸合成肽的肽固相合成法技术，通过化学合成制作了生长因子蛋白质序列和c末端侧带有DOPA的粘附性肽连接而成的多肽(粘附性生长因子)的全长(图1 )。
图1通过连接含1 DOPA粘合性肽的粘合性生长因子对材料表面赋予生理活性
通过在生长因子的末端连接含DOPA的粘着性肽制作粘着性生长因子，在材料表面添加该溶液后，在DOPA的作用下在表面形成了提示生长因子的纳米层。 在该层上培养细胞时，表面固定的生长因子和细胞膜上的受体相互作用，促进细胞增殖和分化的效果得到了确认。
具体而言，在上皮细胞生长因子( EGF ) [7]和IGF-1 (以下称为IGF )各自的c末端，添加含DOPA的粘着性肽序列X-K-X-K-X-G(X:DOPA，k :赖氨酸，g :甘氨酸) 在作为金属材料的钛、作为陶瓷材料的羟基磷灰石、作为有机材料的聚苯乙烯的各材料表面评价溶解于弱碱性水溶液的两多肽的结合性时，发现任意材料表面上由于含DOPA的粘合性肽的连接而生长因子蛋白质的结合量增加
图2粘结性生长因子在材料表面的结合量a :上皮细胞生长因子( EGF )和多肽EGF-DOPA在材料表面的结合量。 Ti表示金属材料的钛，HA表示陶瓷材料的羟基磷灰石，PS表示有机材料的聚苯乙烯。 仅用EGF与材料表面的结合弱(虚线)，但含有DOPA的多肽中发现了强结合(实线)。b :胰岛素样生长因子( IGF )和多肽IGF-DOPA在材料表面的结合量。 光靠IGF与材料表面的结合很弱(虚线)，但是含有DOPA的多肽中，钛和羟基磷灰石表现出了很强的结合(实线)。
图2粘结性生长因子在材料表面的结合量a :上皮细胞生长因子( EGF )和多肽EGF-DOPA在材料表面的结合量。 Ti表示金属材料的钛，HA表示陶瓷材料的羟基磷灰石，PS表示有机材料的聚苯乙烯。 仅用EGF与材料表面的结合弱(虚线)，但含有DOPA的多肽中发现了强结合(实线)。
接着，对EGF-DOPA和IGF-DOPA在表面固定时的生理活性进行了评价。 在3种材料表面固定了EGF-DOPA的表面上培养了NRK49F细胞(来源于大鼠肾)，结果确认，与无粘着性肽的普通EGF存在于培养液中的情况相比，各材料表面的细胞增殖诱导效果最大为约1.5倍(图3A-C )。 在固定了IGF-DOPA的钛表面，对伴随MC3T3-E1细胞(来源于小鼠头盖)的成骨细胞分化的钙化进行了评价，确认与通常的IGF相比，分化诱导效果最多增加了2.2倍(图3D )。
图3粘附性生长因子的生理活性评价a，b，NRK49F细胞(来源于大鼠肾)在C:EGF-DOPA固定化表面上的增殖诱导效果。 相对细胞数表示在不添加EGF的条件下以细胞数为100%时的比率。 表示钛上的效果，b表示羟基磷灰石上的效果，c表示聚苯乙烯上的效果。 与通常的EGF相比，各材料表面的细胞增加率最多增加了约1.5倍。 例如，在b的例子中，( 159-100 )/(139-100 ) =1.51。D:IGF-DOPA固定化钛表面上的MC3T3-E1细胞(来源于小鼠头盖)的成骨细胞诱导能力评价。 用茜素红染色后，通过吸光度测定进行定量化。 与通常的IGF相比，细胞分化引起的吸光度增加率最大增加了2.2倍。
另外，发现固定在钛表面的EGF-DOPA不会进入细胞内，而是持续刺激细胞，诱导增殖。 另外，共聚焦显微镜[8]的观察结果表明，固定化的EGF-DOPA从细胞的粘合面刺激细胞(细胞膜上存在的受体) (图4 )。
图4 EGF-DOPA固定化表面上的细胞刺激α-α'、β-β'、γ-γ'、δ-δ'分别是俯视图所示的处的垂直剖视图. 红色部分表示由EGF刺激的细胞膜受体(磷酸化的EGF受体)，蓝色部分表示细胞核。 在左侧没有DOPA的普通EGF中，整个细胞膜上分布着EGF刺激处，但在右侧的EGF-DOPA表面上，EGF刺激处集中在底部，可以看出EGF-DOPA从细胞的粘合面刺激着细胞。 标尺为5微米( μm，1μm为1，000分之1mm )。
今后的期待通过本研究，确立了具有粘接性、促进细胞增殖和分化诱导的2种多肽在不损害活性的情况下，固定在钛、羟基磷灰石、聚苯乙烯各材料表面的方法。 能够将多种生长因子蛋白质固定在金属、陶瓷、塑料的各材料表面，表明了本方法的通用性之高。 目前使用的生物材料涉及很多方面，今后进一步提高生物亲和性将成为课题。 因此，通过活用本方法，将与利用部位相应的分子固定在各材料表面，有望为开发更适合生物体内环境的人工脏器做出贡献。另外，近年来，信息通信技术和元件的小型化不断发展，将来期待着体内埋入型生物体内信息测量设备的开发。 由于本研究的方法可以修饰各种各样的材料表面，相信对实现各种各样的生物功能性的埋入型测量仪器也有贡献。
补充说明1 .翻译后修饰氨基酸蛋白质和肽通过在生物体内的翻译反应，连接20种氨基酸进行生物合成，虽然与那20种结构不同，但被确认为天然存在的氨基酸。 这样的氨基酸是通过翻译反应生成的蛋白质和肽通过酶反应接受官能团修饰(翻译后修饰)而合成的，因此被称为“翻译后修饰氨基酸”。2 .多肽多种氨基酸通过肽键连接而成的化合物。3 .固相合成法化学合成法之一，是通过将分子连接在珠子等固相上，放入反应试剂的溶液中，使合成反应阶段性进行的方法。 与在液相中进行的普通合成法相比，容易从生成物中除去未反应的反应试剂和副产物，被用于核酸和肽的合成。4 .紫贻贝在食用的情况下，也被称为毛姆贝，可以被足线强力粘接在湿润的岩石带上，因此其机构也成为了生物粘接材料的研究对象。5.3，4 -二羟基苯丙氨酸( DOPA )是酪氨酸的芳香族基团上附加了羟基的氨基酸，经翻译后修饰在蛋白质中生成。6 .胰岛素样生长因子1(IGF-1 )一种分子结构类似于胰岛素的激素，IGF-1由70个氨基酸组成，分子量为7649。 与存在于细胞表面的固有受体结合，在细胞生长的调节中起重要作用。7 .上皮细胞生长因子( EGF )由53个氨基酸组成的分子量为6045的蛋白质。 与存在于细胞表面的上皮生长因子受体结合，在细胞生长的调节中起重要作用。8 .共焦显微镜一种显微镜观察技术，在观察试样的荧光时，通过针孔缩小检测出的荧光范围，从而去除焦点面以外的荧光，仅精细地获取焦点面的荧光图像。 通过连续获取不同高度的多个平面图像并在计算机上重建，可以显示试样的垂直截面图像。联合研究小组物理化学研究所创物性科学研究中心创发生物工程材料研究小组研究员多田诚一研究生院研究协会(研究当时)允浩( Yun Heo )队伍队长伊藤嘉浩(开拓研究总部伊藤纳米医学工程研究室主任研究员)开拓研究总部伊藤纳米医学工程研究室研修生谢里伦( Xueli Ren )访问研究员(研究当时)毛宏理(洪利茂)访问研究员(研究当时)朴克( Shin-Hye Park )专职研究员礒岛隆史访问研究员(研究当时)李平祖( Liping Zhu )国际研究协会(研究当时)肖在旭(小宇Zho )脑神经科学研究中心研究基础开发部门生物物质分析支持单元专业技术员伊藤玲子技术人员ⅰ藏田紫乃技术人员ⅱ大崎惠东京工业大学生命理工学院生命理工学系小畠英理原论文信息教授