科研 | J. Allergy Clin. Immunol.：未结合胆红素与预防早期哮鸣和儿童哮喘有关
编译：微科盟草重木雪，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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哮喘是儿童中最常见的慢性综合症之一，导致大量发病和每年医疗保健支出。哮鸣和过敏反应是儿童哮喘发展最强有力的早期预测因子，然而这些早期表型的分子起源知之甚少。本研究利用ECHO计划队列进行了嵌套病例对照研究，喘息和过敏性致敏分别由1岁时的喘鸣发作次数和阳性特异性IgE定义。研究者使用非靶向代谢组学探究了观察到的和潜在的混杂因素，以评估血浆代谢组与生命早期喘息，过敏和儿童哮喘之间的关联，确定了Z,Z非结合胆红素(UCB)与复发性喘息和儿童哮喘之间的新型负相关和剂量依赖性关联。炎症脂质介体和氧化应激副产物与UCB也呈负相关，表明UCB调节了对早期复发性喘息和儿童哮喘的发展至关重要的途径。本研究对于疾病生物标志物的发现具有一定的借鉴作用。
论文ID
实验设计
实验结果
1. 种群特征和代谢产物鉴定
表1总结了本研究中使用的巢式病例对照样品的特征，在发现数列中，第一年喘息与空气过敏原或食物致敏性无关（p值= 0.50和0.72），表明两种表型之间的重叠很小。
在INSPIRE第一年血浆发现数列中，作者鉴定了938个注释代谢物和265个未注释代谢物，此外4个附加数据集各鉴定了1039至1321个代谢物，而从INSPIRE，WISC和COAST（第一年和第三年）血浆样品中鉴定出的代谢物之间存在大量重叠（824/1512），其中代谢物M-1（C17H20N2O5），M-2（C17H20N2O5）和M-3（C17H18N2O4）半注释为胆红素降解产物。
2. 鉴别与过敏化作用相关的血浆代谢物
在FDR为20％时，INSPIRE血浆数列中没有代谢物与空气过敏原致敏显著相关；然而，在出生后第一年对至少一种食物致敏的INSPIRE儿童相比于正常儿童血浆，α-D-葡萄糖醛酸含量显著升高，并且COAST第一年血浆数列中也有此趋势。
3.发现分析确定与喘息相关的血浆代谢物
18个代谢物丰度与第一年喘息显著相关，其中包括5个未注释的，3个半注释的和10个注释的代谢物（见图1）。半注释的胆红素降解产物M-1和M-2是与喘息最相关的代谢产物（q值= 3.1x10-4、8.8x10-4）。M-1和M-2以及第三种半注释的胆红素降解产物M-3与重要的注释代谢物UCB高度相关（相关系数分别为0.62、0.57和0.87，p值<10-16）。1-3和4+喘息发作的儿童中这三个胆红素相关代谢物的丰度大致相同，且都小于无喘息的儿童（见图2），但是，由于这些代谢物仅是半注释的，仅能支持此结论，还无法确定可靠性。
与第一年喘息显著相关的带注释的代谢物包括琥珀酸酯，亚氨基二乙酸酯，N-（2-糠酰基）甘氨酸，3-氨基-2-哌啶酮，5,6-二氢尿苷，UCB，亚油酰基-亚油酰基-甘油（18：2/18：3），焦谷氨酰胺，反式尿烷酸盐和半胱氨酸-硫酸盐。琥珀酸是最重要的带注释的代谢产物，连同较重要的代谢产物乌头酸盐（q值= 0.248），参与柠檬酸循环，以前曾可以在血清，尿液和呼出气中的冷凝水代谢产物中被观察到，可用于预测成年人和儿童的轻度哮喘，表E4包含所有18种代谢物及其与第一年喘息相关性的完整列表。
在上述十种带注释的喘息相关代谢产物中，三种（3-氨基-2-哌啶酮，5,6-二氢尿苷和UCB）表现出喘息剂量效应。气喘的儿童中3-氨基-2-哌啶酮和5,6-二氢尿苷的丰度高于没有气喘的儿童（见表E4），但是，这两个关联的方向未能在WISC队列中复现，因此被排除在进一步分析之外。
相比不喘息儿童，喘息发作1-3和喘息发作4+儿童的UCB丰度平均降低了13％（β1-3= 0.87，95％CI=0.74-1.02）和22％（β4+=0.78，95％CI = 0.68-0.91）（见图3A）。这些结果由UCB光异构体E,Z/Z,E未结合胆红素总结得出（q值= 0.214；图E8）。血浆UCB丰度与儿童哮喘（β哮喘= 0.82，95％CI = 0.68-0.98；图3B）之间存在相似的关系，并且WISC数列中也重现了此关联，因此，进一步分析中选择了唯一与喘息相关的代谢物-UCB。
4. 复制UCB和喘息之间的关联
作者使用复制数列来评估UCB水平和喘息之间横断面关联的可复制性，并给出发现数据中与将来哮喘的关系，进一步评估UCB对儿童哮喘的影响。图3A展示了UCB与喘息发作4+的横断面关联程度及方向，除了最小样本量的数据集（喘息发作1-3）外，所有重复数列都是一致的。
图3B结果显示，在重复发现数据中观察到儿童哮喘依赖于UCB水平。在第1年和第3年COAST数据集中观察到的与哮喘之间的密切联系（1面p值= 0.00376和0.0252）表明UCB还可以预防哮喘，此外，半注释的胆红素降解产物M-1，M-2和M-3与喘息和哮喘之间的关系映射了所有上述关联（请参见图2），表明这种UCB相关途径可能可以预防喘息和未来哮喘。作者注意到，从包含重叠个体的1年和3年COAST数据集得出的估计值之间的相关系数很小，可以忽略不计，这意味着将图2和3中所有四个数据集的估计值视为独立值即可（请参见在线补充方法和详见表E6）。
最后，我们进行了交叉表型荟萃分析，该模型汇总了重复数列以及喘息和哮喘表型之间的信息，以明确测试在发现数据集中观察到的UCB水平与呼吸表型之间的关联方向是否在重复数据集中复现。显著p值0.00638与图3中的结果一致，表明UCB水平与呼吸表型之间的关系在整个人群中是一致的。
5. 与血浆UCB相关的代谢产物确定促成早期喘息的潜在作用机制
为了确定UCB预防喘息和哮喘的潜在机制，作者接下来试图确定UCB的相关邻近物。共确定了32种代谢物，其丰度对数与UCB的丰度对数显著相关（见图4）。除了三种半注释的胆红素降解产物外，与UCB最正相关的代谢产物是UCB的光异构体（E,Z/Z,E非结合胆红素和E,E非结合胆红素）和biliverdin（血红素向UCB分解的中间体）。尽管UCB的光敏异构体表现出喘息剂量反应，但当FDR为20％时，它们与第一年喘息的关联并不显著（见图E8）。
花生四烯酸(AA)等二十烷类代谢途径的关键代谢产物是与UCB丰度对数负相关的15个代谢产物之一。由于LTB4仅在14%的INSPIRE样本中观察到，并且是喘息儿童中最普遍存在的代谢物，考虑到AA在类花生酸生成中的作用，研究者探究LTB4是否与UCB的丰度相关。作者观察到血浆UCB水平与LTB4的几率增加相关（p值为6.19×10-4;见图5B），这表明LTB4可能介导UCB与喘息之间的关系（见图5C）。即使考虑了AA丰度的差异，这种统计上显著的反比关系仍然存在，而鉴定出的唯一其他类花生酸为12-羟基二十碳四烯酸（12-HETE），在24％的INSPIRE儿童中观察到。UCB的丰度与12-HETE呈反比关系，尽管无统计学意义（见图E9）。血浆氧化应激副产物的水平，例如甘油磷酰胆碱（GPC）和甘油磷酸乙醇胺（GPE）（次氯酸诱导的缩醛磷脂降解的产物）以及5-氧代脯氨酸（谷氨酸衍生物）的水平与UCB丰度成反比（见表E5）。
讨论
为了进一步理解哮喘发展潜在分子机制，作者研究了哮喘发展的两种最重要的早期生命危险表型-喘息和过敏性致敏，和儿童哮喘的血浆代谢组学特征。作者应用了一种新颖而严格的统计方法来纠正非随机丢失的数据和未观察到的混杂因素，并使用独立的重复数列，复现了发现数列中推测的影响因素和关联程度。
作者在发现分析中鉴定出18个血浆代谢物与第一年喘息显著相关。在十种带注释的喘息相关代谢产物中，只有正常血红素分解代谢副产物UCB与第一年的喘息表现出可复现的剂量依赖关系，其中较高的血浆UCB水平与较少的喘息发作相关。高危人群和非高危人群的关联程度和方向以及剂量反应均一致；此外，UCB水平也与儿童哮喘有保护性关联，这表明UCB水平降低先于喘息和哮喘发作；最后，非常值得注意的是，喘息和三种半注释的假定胆红素降解产物之间的关系反映了上述所有四个数据集中喘息和哮喘-UCB关联，表明UCB的衍生物可能也有助于预防婴儿喘息。
研究者还发现UCB及其相关代谢产物对早期哮喘和儿童哮喘具有强保护作用，这与最近的研究结果一致，表明轻度升高胆红素水平对呼吸条件有保护作用，但是，这些观察性研究是在成人中进行的，仅考虑总胆红素，结合和未结合胆红素浓度之和；此外，以前的研究都没有办法来评估胆红素异构体的相对影响；最后，这是一项前瞻性的病例对照研究，旨在发现胆红素与喘息风险和儿童哮喘之间的关联，同时也是首次发现胆红素发挥其潜在保护作用的可能保护途径。
与此研究相反，以前的报道表明高胆红素血症与患哮喘的风险增加有关，但是，这些研究并未测量胆红素，而是依赖于黄疸的诊断或光疗史。此外，最近对婴儿进行的一项研究测量了总血清胆红素（TSB），发现低至中等TSB（≤5.9mg/dL）和最高TSB（> 18mg/dL）的儿童之间没有差异。Kuzniewicz等研究只能表明，TSB浓度比正常生理范围内高2到3倍的婴儿患哮喘的风险增加，而该研究测量了未结合的胆红素，并证明在正常生理范围内较高的浓度与预防哮喘有关。这表明如果胆红素是哮喘发展的原因，此研究和那些使用上极值的研究结果表明胆红素水平和哮喘风险之间的关系遵循抛物线关系，中度低水平和极高水平的胆红素会增加哮喘和哮喘发展的风险。
哮喘小鼠模型表明，UCB具有许多抗炎特性，但是，UCB与人类早期喘息减少和儿童哮喘相关的机制尚不清楚。因此，研究者使用相关性分析和文献回顾推测UCB保护婴儿免受哮鸣和哮喘影响。值得注意的是，UCB水平与AA和LTB4的水平成反比，这与实验结果一致，表明UCB在生理相关浓度以剂量依赖性方式抑制了分泌型磷脂酶A2（sPLA2）酶家族（包括sPLA2IIA）的许多成员。UCB在体外对sPLA2IIA的抑制作用是不可逆的，并且与底物浓度无关，即使在调整AA丰度后，UCB的丰度和LTB4之间存在显著逆向关系，这与UCB作为5-脂氧合酶（5-LOX）抑制剂的作用一致。sPLA2IIA和5-LOX的抑制依赖于UCB亲脂性可能有助于解释为什么E,E未结合的胆红素水平与喘息没有那么紧密的联系，因为Z到E胆红素的异构化会减少分子内氢键并使亲脂性降低。这些结果表明，UCB可以抑制呼吸道感染中LTB4的产生，这将减少单核细胞和白细胞的迁移和趋化性，以及气道中性粒细胞生成的超氧化物的产生。
作者还观察到血浆UCB与溶血磷脂酰胆碱18：2（LPC 18：2）和溶血磷脂酸18：2（LPA 18：2）水平之间显著负相关。sPLA2s裂解膜磷脂产生LPC 18：2，然后被自身生物素水解产生LPA 18：2，这表明UCB可能通过抑制溶血磷脂酸的合成来预防早期的喘息和儿童哮喘，溶血磷脂酸在变应性炎症期间在人支气管灌洗液中上调，并导致气道损伤，纤维化和血管通透性。
另外，UCB通过抑制NADPH氧化酶而成为有效的抗氧化剂，NADPH氧化酶是许多活性氧的来源。除了减轻气道炎症和过度反应外，这种活性还可以解释血浆UCB水平与次氯酸诱导的缩醛磷脂降解产物GPC和GPE之间的负相关性，以及氧化应激指标5-氧代脯氨酸的相关性。
鉴于UCB在预防早期喘息和儿童哮喘方面可能发挥的作用，因此了解血液UCB水平变化的潜在根源非常重要。UCB由肝脏排泄，其中第一步和限速步骤是与尿苷-二磷酸葡糖醛酸酯酸葡糖醛酸转移酶1A1（UGT1A1）催化的葡糖醛酸结合。UGT1A1活性稍有受损的人的血液UCB水平通常升高，这在UGT1A1基因的遗传变异（吉尔伯特综合症）中通常能被观察到；UGT1A1酶也可以被其他代谢物抑制，例如，视黄醇（维生素A）在体外以生理相关强度竞争性抑制UGT1A1，因此，在INSPIRE队列中观察到血浆视黄醇和UCB水平显著正相关，可能是由于视黄醇抑制了UCB的结合。未来研究针对健康儿童中UCB变异的来源，包括遗传，表观遗传和微生物组贡献，以及饮食和接触史，可能有助于哮喘预防策略。
此研究受益于大型发现队列以及两个独立的复制队列。通过使用专门设计用于研究喘息和哮喘的出生队列的统一数据集，从而能够利用ECHO和CREW出生队列创建的基础架构；另一个重要的优势是此分析流程同时考虑了潜在的混杂因素和非随机丢失的质谱数据，这有助于确保结果准确且可复制。这项观察性研究的局限性包括代谢物水平与喘息之间不确定的因果关系；但是，发现UCB水平与喘息发作次数呈反比剂量关系，并且UCB水平与未来的喘息和儿童哮喘病呈负相关，这一事实支持了UCB实际上可以预防喘息和哮喘发展的假设；其次，使用不同的抗凝剂收集从发现和复制数列中收集的血浆，前者使用EDTA，后者使用肝素，这可能会导致代谢组学结果有差异。虽然抗凝剂不同可能对结果有影响，但队列之间的代谢物重叠程度以及UCB与喘息关联的稳健性仍然令作者备受鼓舞。
结论
该研究确定了未结合的胆红素及其相关代谢产物与哮喘和儿童哮喘的新型逆向关联，并绘制了其可能的计算机作用机制。这些发现为其他实验系统中的机制研究奠定了基础，以证实这些关系，并可能提供新的治疗方法，以减轻婴儿的喘息性疾病，并可能降低随后发生儿童哮喘的风险。