科研 | 中科院：龙血树中 bHLH基因家族的鉴定揭示了参与类黄酮生物合成的候选基因（国人佳作）
编译：Sophie，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Identification of the bHLH gene family in Dracaena cambodiana reveals candidate genes involved in flavonoid biosynthesis
译名：龙血树中bHLH基因家族的鉴定揭示了参与类黄酮生物合成的候选基因
期刊：Industrial Crops & Products
IF：4.191
发表时间：2020.03
通讯作者：彭世清
通讯作者单位：中国科学院热带生物科学与生物技术研究所
DOI号：10.1016/j.indcrop.2020.112407
实验设计
龙血树（D. cambodiana）植物生长在相对湿度保持在60%的温室中，白天14 h/28°C，夜间10 h/20°C。诱导剂处理：在3年生植物的茎上注射10%龙血诱导剂，在处理0、3和6天从注射部位上方6 cm处采集样本。UVB处理：用UVB对龙血树植物进行了辐射试验，在处理0、3、12和24 h，采取每个处理的三次重复的相同位置的叶片。
从先前龙血树的茎转录组数据库中获得了候选的bHLH unigenes，对候选bHLH unigenes进行鉴定，建立拟南芥和龙血树的bHLHs系统发育树。用生物信息学手段预测DcbHLHs的蛋白理化性质、保守motifs、基因结构、亚细胞定位、互作网络和类黄酮合成基因启动子的顺式元件。
用试剂盒提取总RNA，构建cDNA文库，在Illumina HiSeqTM2000平台上进行测序。通过质量控制得到clean reads。基因表达水平用FPKM计算。在“FDR<0.001”和“log2比值≥1”的参数下鉴定差异表达基因。
瞬时侵染洋葱表皮细胞进行亚细胞定位。采用实时定量PCR（qPCR）技术研究DcHLH5与类黄酮合成相关基因的表达相关性。进行酵母单杂试验（Y1H）和农杆菌介导的瞬时表达分析。
结果
1 DcbHLH基因家族的鉴定及特性
从先前研究的茎转录组数据中，共鉴定出82个bHLH unigenes。用Pfam和CDD数据库对这些unigenes是否包含bHLHs的保守结构域进行了筛选，62个命名为DcbHLH1到DcbHLH62的序列被确认为bHLH基因。这些DcbHLH基因被预测编码153（DcbHLH31）-682（DcbHLH5）个氨基酸的蛋白质，分子量在16.35kda（DcbHLH31）-75.75kda（DcbHLH5）之间，等电点为4.75（DcbHLH7）-11.2（DcbHLH58）。所有DcbHLHs的GRAVYs均为负数，表明DcbHLHs可能是亲水性的。两个bHLH蛋白（DcbHLH50和57）的不稳定性指数均小于40，属于稳定蛋白，其他DcbHLHs都是不稳定蛋白。脂肪指数为57.13-98.12。预测亚细胞定位表明，所有的DcbHLHs都可能定位于细胞核。
2 DcbHLHs的系统发育、保守motifs和基因结构分析
用龙血树的62个bHLHs和拟南芥的132个AtbHLHs构建了系统发育树。除DcbHLH24和58外，所有bHLH成员根据拟南芥bHLH超家族的分类，聚集成19个亚家族（图1）。没有DcbHLHs分到Ib、IIIa、VIIa、VIIb和VIIIc亚家族中。三个bHLH成员（DcbHLH2、55和56）和DcbHLH5分别聚类到III（d+e）亚家族和IIIf亚家族。有研究表明，III（d+e）和IIIf亚家族的基因调节多种植物类黄酮合成。说明，III（d+e）和IIIf亚家族中的DcbHLHs也可能调节龙血树类黄酮的生物合成。
本研究用MEME检测了10个保守motifs（图2）。所有DcbHLHs都包含motifs 1和2，构成保守bHLH结构域。同一亚家族的DcbHLHs具有相似的motifs，进一步支持了它们的系统发育关系。不同亚家族间也存在显著差异，某些motifs仅在特定亚家族中检测到，表明这些基序在亚家族中具有特定的功能。Motif 9只存在于III（d+e）和IIIf亚家族中，表明该motif可能在类黄酮生物合成中发挥特定作用。
图2 基于系统发育关系的DcbHLHs保守motifs和基因结构分析。A. DcbHLHs的邻接法系统发生树。B. DcbHLHs中的保守motifs。用MEME识别了10个motifs，这些motifs用不同颜色的盒子表示。C. DcbHLHs的基因结构。
根据DcbHLH基因的进化分类，构建了DcbHLH基因的外显子-内含子结构。结构分析表明，DcbHLH基因内含子的数量在0-9个之间。其中6个基因没有内含子（DcbHLH2、11、24、51、56和58），2个基因（DcbHLH8和dcbhl48）内含子数量最多（9个）。同一亚家族的大多数DcbHLH基因具有相似的外显子/内含子分布模式。但是，Ivb亚家族成员具有不同数量的内含子（4-7个），并且在外显子长度上也各有不同。
3 DcbHLHs表达模式
在62个DcbHLHs中，16个DcbHLHs（DcbHLH2、3、5、6、7、20、21、22、23、43、50、51、52、53、54和56）在诱导剂处理的植株中显著上调。处理6天后，这些基因的表达水平趋于稳定。相反，DcbHLH1、4、8、9、13、14、15、17、18、19、33、39、45、46、47、48和49的表达水平在诱导剂的作用下显著下调（图3A）。
图3 诱导剂和UVB处理对植物DcbHLHs表达的影响。A. 诱导剂处理后龙血树茎中DcbHLHs的表达水平。B. UVB处理后龙血树叶片中DcbHLHs的表达水平。用每个基因的FPKM的log2值创建热图。
本研究对UVB处理的叶片进行了转录组学分析。结果表明，41个DcbHLHs在叶片中均有表达。其中，18个基因上调，20个下调。转录组数据还显示，大多数上调基因（DcbHLH6、21、23、24、35、38、43、44、49、51、56和61）的表达在UVB处理3 h后达到最大值，DcbHLH2、5、30、31和41表达在UVB处理24 h后达到最大值，DcbHLH55表达在处理12小时后达到最大值（图3B）。
4 DcbHLHs的互作网络分析
以上结果表明，植物在诱导剂和UVB处理下，8个DcbHLHs（DcbHLH2、5、6、21、23、43、51和56）表达上调，表明这些基因可能调控龙血树的类黄酮合成。用STRING 11构建了DcbHLH2、5、6、21、23、43、51和56的蛋白质相互作用网络。有56个候选蛋白被预测与这些DcbHLHs相互作用，并且大多数互作蛋白是转录因子（图4）。20个蛋白与DcbHLH2（与拟南芥MYC4同源）和DcbHLH56（与拟南芥AT4G1260同源）互作，参与JA信号转导。DcbHLH5（与拟南芥GL3同源）与花青素积累所需的TTG1结合，还与促进花青素生物合成的MYB75相互作用。结果表明，DcbHLH5可能调节类黄酮的生物合成。
图4 用拟南芥同源序列进行DcbHLHs的相互作用网络分析。
5 DcbHLHs亚细胞定位
选择3个可能与类黄酮生物合成有关的DcbHLHs（DcbHLH2、5和56）进行亚细胞定位分析。35S::DcbHLHs-GFP融合蛋白转化的细胞的绿色荧光信号特异性地定位于细胞核中（图5）。结果表明DcbHLH2、DcbHLH5和DcbHLH56是核定位蛋白。
图5 DcbHLH2、DcbHLH5和DcbHLH56的亚细胞定位。DcbHLH2-GFP、DcbHLH5-GFP、DcbHLH56-GFP和对照质粒在洋葱表皮细胞中瞬时表达。培养36 h后用共焦荧光显微镜观察荧光。
6 DcbHLH5与类黄酮生物合成基因的共表达
以上结果表明，DcbHLH5可能参与调控类黄酮生物合成。用qRT-PCR法测定了诱导剂和UVB处理下植物DcbHLH5、DcCHS1、DcCHS2和DcCHI1的表达水平。DcbHLH5和类黄酮生物合成基因（DcCHS1、DcCHS2和DcCHI1）的转录水平上调，并且其表达模式在诱导剂或UVB处理下高度相关（图6）。这些结果证实了转录组数据的可靠性，并表明DcbHLH5可能调节类黄酮生物合成基因的表达。
图6 DcbHLH5与类黄酮生物合成基因的共表达。A. DcbHLH5、DcCHS1、DcCHS2和DcCHI1在诱导剂处理下的龙血树茎中的表达模式。B. DcbHLH5、DcCHS1、DcCHS2和DcCHI1在UVB处理下龙血树叶片中的表达。*，P<0.05；*，P<0.01。
7 DcbHLH5对类黄酮合成基因启动子的反式激活
本研究克隆了DcCHS1、DcCHS2和DcCHI1的启动子序列。三个启动子序列都含有假定的bHLH DNA结合motifs（E-box元件）（图7A）。Y1H分析发现，DcbHLH5与酵母中DcCHS1、DcCHS2和DcCHI1的启动子结合（图7B）。
图7 DcbHLH5对类黄酮合成基因启动子的反式激活作用。A. DcCHS1、DcCHS2和DcCHI1启动子中E-box motifs的分布。B. 酵母中DcbHLH5与DcCHS1、DcCHS2和DcCHI1启动子的相互作用。C. DcbHLH5对DcCHS1、DcCHS2和DcCHI1启动子的转录激活。*，P<0.05；*，P<0.01。
使用Dual-LUC检测系统验证DcbHLH5是否调节类黄酮通路基因的表达。与对照相比，表达DcbHLH5的细胞对DcCHS1、DcCHS2和DcCHI1启动子的激活率分别为4.9、4.2和3.9倍（图7C）。这些结果进一步支持了DcbHLH5调节类黄酮生物合成基因的表达。
结论
本研究鉴定了62个龙血树bHLH基因。进化关系、转录组和相互作用网络分析表明，DcbHLH2、DcbHLH5和DcbHLH46可能参与类黄酮类生物合成。共表达、Y1H和Dual-LUC分析表明，DcbHLH5与类黄酮类生物合成基因启动子结合，以增强其转录，揭示了DcbHLH5参与了黄酮类生物合成。这些结果为进一步研究DcbHLHs在类黄酮生物合成中的作用提供了有力的基础。
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