编译：怀瑾，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
癌症干细胞对于癌症的发生、发展和耐药性至关重要，但目前对于这些过程及其与胶质母细胞瘤异质性相关性的理解有限。因此，本研究对成年胶质母细胞瘤细胞和正常人胎儿脑细胞进行单细胞RNA测序，并将发育的人脑的谱系层次与癌细胞转录组比较，发现以神经胶质祖细胞样细胞为中心的保守的神经三系癌症体系。该祖细胞群包含大多数癌细胞的循环细胞，并且利用RNA速度，通常是其他细胞类型的始祖。简言之，本研究表明正常的大脑发育与胶质母细胞瘤的发育一致，提示胶质母细胞瘤异质性的可能来源，有助于鉴定癌症干细胞特异性靶点。
原名：Single-cell RNA-seq Reveals That Glioblastoma Recapitulates a Normal Neurodevelopmental Hierarchy
译名：单细胞RNA序列揭示复发性胶质母细胞瘤的一般神经发育层次
期刊：Nature Communications
IF：11.878
发表时间：2020.7
通讯作者：Kevin Petrecca
通讯作者单位：麦吉尔大学，蒙特利尔神经科学研究所
DOI号：10.1038/s41467-020-17186-5
分子和基因组异质性，以及放射疗法和化学疗法后干细胞样的癌细胞亚群持续存在，被认为是肿瘤耐药性的主要原因，常伴有较差的预后。IDHwt胶质母细胞瘤是最常见的成人原发性脑癌，具有高度的肿瘤异质性和耐药性。癌症基因组图谱（TCGA）研究通过基因组和转录组分析建立了患者间的异质性。对分化细胞的全肿瘤转录组数据分析，胶质母细胞瘤可分为四个主要的亚型：前神经元型，神经元型，经典型，间质型，但这些亚型之间的生存率没有差异。多种细胞亚型共同存在于同一区域，同一肿瘤内也包含不同的细胞亚型。这种患者间和肿瘤内的异质性无疑为癌症治疗提出新的挑战，也部分解释目前癌症治疗的低效性。尽管神经发育双系层次可以部分解释IDH突变神经胶质瘤和儿科神经胶质瘤的异质性，但不能应用于成年IDHwt胶质母细胞瘤。胶质母细胞瘤的干细胞样细胞亚群的发现，为癌症研究提供新的思路。胶质母细胞瘤干细胞（GSC）具有自我更新以及产生分化后代的能力，而且具有放射疗法和TMZ化疗抵抗。不同肿瘤中的干细胞表达不同的标志物，提示干细胞区室内也存在一定程度的患者间和/或肿瘤内异质性。这些发现均表明GSC可能在癌症的发展和复发中起重要作用。
1.ScRNAseq揭示胶质母细胞瘤的基因组异质性及其保守的神经发育谱系
研究者利用基于液滴的scRNAseq获取IDHwt胶质母细胞瘤细胞和胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）的转录组。对16例患者的细胞（包括全肿瘤细胞和GSCs）进行测序，从其转录组中确定了每个细胞中的主要拷贝数畸变（CNA）数以区分癌细胞与正常脑细胞。鉴定出两个不含已知的CNAs同时包含几乎所有肿瘤细胞的细胞簇（图1a）。（这些细胞仅表达髓样细胞，少突胶质细胞或内皮细胞中的基因，因而归为正常细胞。）有时，来自特定患者的细胞通过t分布随机邻居嵌入（tSNE）产生了两个或三个亚群，这可能表明肿瘤内有不同的克隆（图1a）。这些发现共同证明了肿瘤间和肿瘤内基因组异质性。研究者基于单细胞转录组数据评估全肿瘤和GSCs的肿瘤内异质性。对富集的GSCs进行主成分分析（PCA），对全肿瘤样本进行PCA和聚类非负矩阵分解（cNMF），以更好地了解观察到的特征。对于每个GSCs富集的肿瘤，我们发现第一主要成分（PC）将细胞分为不同神经发育谱系。表达神经元基因（如CD24，SOX11和DCX）的GSCs与表达星形细胞（包括星形-间质）基因（如GFAP，APOE等）的细胞相互排斥（图1b）。为了评估这些基因在患者中的保守性，根据对PC1的影响强度对基因进行排列，并发现这种排列在样本之间具有高度相关性（图1c）。具有中等PC1值的GSC表达祖细胞基因（如SOX4，OLIG2和ASCL1）（图1b）。此外，还比较了GSCs富集样品中每个细胞的标志，以确定它们的TCGA亚型，每位患者都存在不同阶段的细胞（图1b）。研究者使用流式细胞仪验证GSCs富集和全肿瘤细胞的差异基因表达谱，细胞不会共表达神经元（如CD24）和星形细胞（如CD44）标记（图1d）。总之，这些数据表明，GSCs由祖细胞、神经元和星形细胞基因表达谱共同构成，类似于发育中的大脑。为了更好地表征全肿瘤样本的异质性，研究者进行cNMF分析，发现每个样本都有五到九种特征，可分为七组（图1e）。对每组的特征性基因分析，发现第一和第二组表达对细胞G1S和G2M期非常重要的基因和一些干细胞基因（如EZH2），而第七组表达对缺氧反应重要的基因（图1e）。第三和第四组密切相关，分别表达与少突祖细胞和神经元细胞相关的基因（图1e）。第五和第六组表达与星形细胞分化相关的基因。而且每个患者样本均具有上述特征（图1f）。我们将这些特征与TCGA分析获得的特征进行比较（图1e），细胞周期、少突祖细胞和神经元特征与前神经元亚型相关；而缺氧特征与间充质亚型相关；两个星形细胞特征分别与经典亚型，间充质亚型匹配；无与神经亚型匹配的特征。
图1.ScRNAseq揭示胶质母细胞瘤和胶质母细胞瘤干细胞的转录组异质性
a. 所有肿瘤细胞的tSNE位置平均转录组(不同着色代表不同患者)。b.富集的GSCs基因表达热图。c.基因的平均和实际排名。d. 流式细胞术分析GSCs和整个肿瘤，结果显示CD24和CD44的表达相互排斥。e. 基因表达热图（cNMF分析）和TCGA亚型（右）
2.单细胞RNA测序正常发育的大脑
如果胶质母细胞瘤的组织构架能反映正常大脑的发育，那么在单个细胞水平上与发育中的大脑进行直接比较能提供更多新的认识。研究者对四个人类胎儿的端脑细胞进行scRNAseq。除去室管膜细胞后，将所有胎儿大脑的总细胞和CD133阳性细胞数据集进行计算机合并，并使用Louvain算法将细胞按类型分组（图2a，b），共分为10个细胞簇（图2a）。CD133阳性细胞存在于所有簇/细胞类型中，但在放射状胶质细胞、神经元祖细胞和定型胶质细胞簇中富集（图2d）。两种CD133阳性细胞类型不符合先前鉴定的基因特征，第一种主要在17周和19周的大脑中检测到，并且高度表达诸如VIM、GFAP、OLIG等基因（图2a,uRG）。在Nowakowski等人数据集中，这与某些类型的放射状胶质细胞最为相似。第二种细胞类型是未鉴定的神经胶质细胞簇，在所有胎龄中均被检测到，并高度表达少突胶质细胞谱系基因（如OLIG1，OLIG2和PDGFRA），神经胶质/星形细胞谱系基因（如GFAP，SOX9等）和祖细胞基因（例如ASCL1，MKI67 等）（图2c，虚线环绕神经胶质簇以及少突胶质细胞和星形胶质细胞簇进行比较）。相应地，在Nowakowski等人数据集中，与星形胶质细胞和少突胶质细胞祖细胞高度相关。但它不表达星形胶质细胞或少突系胶质细胞（OLCs）分化标志（如APOE和APOD）（图2c）。这种混合的基因特征与双能神经胶质祖细胞（GPC）相一致。而且这种GPC特征几乎只能在分选的CD133细胞中鉴定出来（图2a，d），这也可能是之前未曾检测到它们的原因。在首次传代培养的胎儿脑细胞（来自已经测序的胎儿脑组织）（图2e）以及在成年人脑的脑室下区域（图2f），证实了表达GPC标记的细胞的存在。
图2. 对正常发育的大脑进行ScRNAseq并鉴定神经胶质祖细胞
3. 胎儿脑路线图揭示胶质母细胞瘤以祖癌细胞为中心的三系体系
研究者接下来目的是找到每种癌细胞与胎儿脑细胞类型的相似之处，为此开发了一种路线图技术，可将每个癌细胞投射到胎儿数据集上。用于构建路线图的五种细胞类型是星形胶质细胞;截短的放射状胶质细胞（tRG）; GPCs; OLCs和中间神经元。之后利用PCA分析，以胎儿PC空间充当路线图，结合扩散嵌入在3D空间展现分化过程，在少突胶质细胞，星形细胞，tRG和神经元谱系的交界处发现了GPCs（图3a）。将每个患者的癌细胞等量投射到此路线图上，并以扩散嵌入的前三个扩散成分作为每个细胞在层次结构中的坐标（图3b）。患者的GSCs和全肿瘤细胞重叠（图3c）。GPC特征是唯一一个在所有患者中都高度表达的，为了可视化基因特征，根据三个扩散成分（DC）分别对癌细胞进行排序，并发现与此排序最相关的基因（图3d）。在DC2的两端分别存在表达OLC标记（如OLIG1，APOD）或星形间质标记（如CD44，GFAP，AQP4）的癌细胞;在DC1的末端发现了表达神经元信号的癌细胞；在DC3和DC2中间发现了表达GPC标记的癌细胞。因此，我们将扩散成分DC3作为神经胶质祖细胞评分。揭示了一个以神经胶质祖细胞为中心的由全肿瘤和GSCs构成的三系组织。当对富集的GSCs和整体的肿瘤细胞进行比较时，我们发现GSCs在胶质祖细胞评分上明显向高值偏移（图3c）。表明胶质祖癌细胞在GSC培养条件下富集，并且在干细胞条件下培养7天后，偏离星形细胞、间充质细胞和少突胶质细胞癌细胞类型。最后使用LDA依据胎儿细胞数据集，将来自整个肿瘤的癌细胞分类（图3a，b）。每个细胞的TCGA亚型与经典的细胞类型进行比较（图3e），发现胶质祖细胞大多是前体细胞，但也存在经典和间充质亚型的细胞。
图3. 胎儿脑路线图揭示胶质母细胞瘤以祖癌细胞为中心的三系体系
4. 祖癌细胞是胶质母细胞瘤的始发者
研究者发现所有的样本都有很高的内含子比率，与小鼠大脑发育过程中观察到的相似。因此，使用RNA速度测量转录动力学并表征胶质母细胞瘤分化过程。为了找到速度的模式，研究者依据上述的细胞类型分类来标记细胞。祖细胞和未分类的细胞根据灰度等级着色（祖细胞得分越高，其颜色越深），突出显示了路线图中看到的分化谱（图4a）。此外，具有相同细胞类型的细胞聚集在一起并位于UMAP外围（图4b），这再次表明这些细胞类型是胶质母细胞瘤固有的。在每个病人样本中都发现了定向流动（图4b），但这不是由于随机性。向量场从胶质祖细胞得分高的细胞指向特定谱系的细胞（图4b）。总之，这些分析表明星形细胞、间充质、少突胶质细胞和神经元癌细胞比祖细胞具有更高的分化能力，而后者通常是胶质母细胞瘤的始祖。
图4. RNA速度支持胶质母细胞瘤保守的发育层次动力学
5.祖癌细胞驱动化疗抵抗和肿瘤生长
根据细胞周期基因的表达，研究者们将循环细胞定义为G1 / S或G2 / M> 1.5的细胞，然后根据它们的神经胶质祖细胞评分来计算循环细胞的比例。发现几乎所有循环癌细胞都具有较高的神经胶质祖细胞评分。接着利用单细胞蛋白质组学分析验证该结果。实验数据均表明祖癌细胞是最有增殖潜力的细胞。为了评估GSC的抗药性和致瘤性，研究者根据上述蛋白表达特征将其分为三类：祖细胞型、神经元型和星形间充质型。三个病人来源的GSC株被分为上述类型并用TMZ治疗。需要不同的剂量以实现不同细胞系的应答，这与肿瘤的甲基鸟嘌呤甲基转移酶状态相关。结果发现与分化程度较高的GSCs相比，祖细胞对TMZ没有反应或反应较少（图5a）。然后，研究者评估了发育层次和谱系对肿瘤形成的影响。将分别来自三名不同患者的祖细胞，神经元细胞，星形细胞或总GSCs进行了无限稀释，原位异种移植至四十七只小鼠。所有移植祖细胞或总GSCs的小鼠，观察其肿瘤形成更早且肿瘤信号增强更快。移植间质或神经元GSCs的小鼠，其肿瘤形成和信号的增加不存在或明显延迟3个月之久（图5b-d）。相应地，移植入祖细胞GSCs的小鼠，其存活时间显著低于植入神经元或星形间充质细胞的小鼠（图5e）。研究者们还分析了异种移植物，以确定每种被移植的GSC细胞类型的后代（图5d）。在第12周，祖细胞GSCs产生了主要表达祖细胞标记ASCL1的癌细胞和少量表达神经元标记DCX或间质标记CD44的癌细胞。神经元GSCs产生了主要表达DCX的癌细胞和少量表达ASCL1的癌细胞。在这些肿瘤中未发现表达CD44的细胞。星形-间充质GSCs产生了非常小的表达ASCL1的癌细胞和少量表达CD44的癌细胞。表达CD44的细胞比例低可能是由于NSG小鼠缺乏免疫微环境。总之，这些结果明确了GSCs中致癌性和化疗抵抗的谱系层次，其中祖癌细胞是最具有化疗抵抗和致瘤性的细胞。这些结果也提示GSC库存在谱系特异性和可塑性。
图5. 祖癌细胞是化疗抵抗和肿瘤生长的驱动因素
6.靶向祖细胞通路的治疗潜力
因为祖细胞GSCs是最具有化疗抵抗和致瘤性的癌细胞群，研究者结合神经发育层次和转录组数据来寻找与此癌细胞群相关的靶点。依据上述LDA分类的细胞类型，研究者选择GPC和星形-间质类群进行分析，将祖细胞群与癌症中最丰富的细胞类型进行比较。基因集富集分析（GSEA）明确了祖细胞中大量富集的途径。在EZH2、FOXM1和Wnt等通路中发现了具有显著相关性的因子，这些都是已知的与CSC自我更新和致瘤性相关的通路。此外还检测到以前未知的通路，其中E2F4通路最为显著，因此用它来验证目标识别方法。E2F基因家族调节细胞周期，对于祖细胞存活很重要，利用E2F4抑制剂靶向该通路。HLM006474是防止E2F4与DNA结合的小分子抑制剂，已被证明可导致胃癌细胞衰老，并在体外降低黑色素细胞和肺癌细胞的增殖和存活。已由研究证明胶质母细胞瘤组织表达E2F4。本研究首次阐明了其在GSCs中的重要性。经HLM006474治疗后，研究者测试其在祖细胞，神经元和星形-充质GSCs中的抑制作用。与神经元和星形-间充质GSCs相比，祖细胞GSCs的增殖和存活率明显降低（图6a）。在干细胞成球实验（图6b，c）以及无血清vs.血清分化的GSCs中也观察到了这种差异性。这些数据表明，靶向E2F4对祖细胞GSC增殖的影响最为显著。接下来，研究者进行体内E2F4抑制实验，用HLM006474或载体处理3天的GSCs被异位移植，结果显示，经HLM006474治疗的小鼠其肿瘤生长显著降低（图6d，e）且存活率改善（图6f）。E2F4的抑制作用对祖细胞GSCs有效，而TMZ化疗对分化程度较高的GSCs更有效，因此认为HLM006474与TMZ联合治疗更有效。研究者先用HLM006474处理GSCs，然后以（TMZ单用无效的）剂量进行TMZ化疗。结果表明，与单独疗法相比，联合疗法将使细胞增殖和存活率进一步降低（图6g）。我们对该组合疗法进行了等效线描记分析，发现在这两种化合物之间不存在协同或拮抗作用，但两者的叠加效应表明其可以组合使用，共同治疗总GSC细胞群中的祖细胞和分化程度更高的GSCs。
图6. 富含祖癌细胞的通路展示出治疗机遇
本研究发现祖细胞是最常见的癌细胞层次结构起始者，也是循环最快的癌细胞类型。在异种移植模型中，GSC库的致瘤性最高，远超过末端CSC，从而推动癌症的生长。在GSC培养条件（此条件下，所有的GSCs都具有分裂能力）下，祖细胞GSCs对TMZ的抵抗性最高。这些快速循环的祖癌细胞通常位于癌细胞层次的顶端，因此可作为靶向的主要细胞群。鉴定该细胞群内的突变或驱动因子，以及祖癌细胞与分化程度更高的癌细胞之间的信号通路改变，可能会发现有意义的治疗新靶标。此研究结果扩展了对胶质母细胞瘤内层次和可塑性的理解。研究者估算癌症中的RNA速度，相关数据表明祖癌细胞具有分化为所有已鉴定癌细胞系的潜能。尽管速度数据显示分化的主要流程为从祖细胞到分化程度更高的细胞谱系，某些谱系与祖细胞群体的相近性提示可塑性发生的可能性，特别是GSC细胞中。此外，各GSC细胞类型的异种移植模型数据提供了GSC群体内谱系定向和可塑性的证据。
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