科研 | PNAS: 转录组学网络分析为玉米叶片表皮发育的调控提供了启示 / 开普饭

编译：凉风月，编辑：十九、江舜尧。

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导读

植物角质层的出现为水生植物适应干燥陆地环境提供了防止水分流失的屏障。角质层成分由蜡和以脂肪酸为基础的聚合物角质，在植物表皮中合成，穿过细胞壁输出，并沉积在植物表面。本研究表明，光敏色素光受体在玉米和小立碗藓的叶片角质层发育过程中都起着重要作用，而这两个陆地植物物种之间的进化相隔超过4亿年。研究者提出了一个假设：光敏色素介导的光信号有助于陆地植物角质层的进化。

论文ID

原文：Transcriptomic network analyses shed light on the regulation of cuticle development in maize leaves

译名：转录组学网络分析为玉米叶片表皮发育的调控提供了启示

期刊：PNAS

IF: 9.582

发表时间：2020.5.18

通讯作者：Isabel Molina & Michael J. Scanlon

通讯作者单位：美国康奈尔大学植物综合科学学院，加拿大阿尔格玛大学

DOI号：10.1073/pnas.2004945117

主要内容

玉米B73种子取自玉米遗传种质中心，在昼夜25℃/20℃，光照时长10h/14h，湿度60%条件下培育直至收获。分析了由3个独立突变体转座子插入等位基因组成的玉米phyb1单株突变。研究了两个phyb1、phyb2的等位基因组合，每个组合导入自交系W22中4次。选取5个小立碗藓和1个野生型小球藻配子体群体作为对照品系，每个群体均含有phy1、phy2、phy3或phy4(由小球藻生态型的同源重组诱导)的单个突变。玉米B73自交系未展开的第8片叶（后续缩写为叶8）在种植后33d左右，叶片长度约为45~55 cm时取样，3次生物学重复，每个重复包含3株叶片。将叶8从轮生叶中分离出来，并在距叶基22 cm处将其分割成的2厘米长的间隔，取其中7个间隔(6个间隔为2-14 cm，1个间隔为20-22cm)固定并嵌入副质体，用于激光显微切割。显微解剖表皮和内部组织，提取RNA，在HiSEQ2500平台测序，用HiSAT2将测序结果与B73基因组RefGen_v3比对，并用HTSeq计数。

表皮角质的蜡用纯氯仿浸泡60秒提取，进行气相色谱-质联用分析。用R的edgeR 3.3.0包对差异基因表达进行分析，筛选出每百万次读取次数少于2次的基因，FDR < 0.1为显著性指标进行分析。WGCN分析采用R中的WCGNA 3.3.0包，并用Python 2.7中的NetworkX 1.11模块进行网络分析。

结果与讨论

1.成年玉米叶片角质层发育的转录组分析

先前的分析表明，玉米自交系B73的展开叶8的近端轴线上角质层成熟的梯度是从近端的遮光区 (距叶基0-16 cm)到远端的光照区域(图1A)。一般说来，随着树叶由暗变亮，较长链蜡成分和角质单体的含量增加。为了捕捉与角质层组成的这些生化变化相一致的转录梯度，研究者沿叶片8的近端轴线的7个发育阶段（代表角质层成熟阶段的全谱），进行了激光显微解剖以进行RNA测序分析(图1B)。每个阶段包括一个2厘米长的间隔，在距叶基2到22厘米之间收集，其中包含叶片组织在17到18厘米处的出苗点(图1A)。对于所检查的7个近端间隔中的每一个，分别对L1来源的表皮样本和L2来源的内部样本进行激光显微解剖(图1B)，然后进行RNAseq以构建它们各自的转录本。

主成分分析(PCA)确定了两个主成分(PC)，这两个主成分共同解释了转录本数据中总样本差异的60.29%。第一个PC对应于分析的7个近端叶片间隔，解释了总样本变异的38.22%，而第二个PC(PC2；样本差异的22.07%)描绘了每个叶片发育阶段的表皮和内部组织(图1C)。这些数据表明，除了角质层组成的生化梯度外，在展开的玉米叶片8中检查的叶间隔也显示出转录梯度。

图1 玉米成熟叶片近、远轴转录本分析。(A)展开的玉米叶片8，虚线划定了沿近端轴线收集的2厘米间隔的边界(注：叶片从轮生到距叶片基部约18厘米处照光)。(实线代表比例尺，2厘米。)。(B)对叶片组织进行激光显微切割，沿着展开叶8的近端轴线分离每个目标叶间隔(A)的L1衍生表皮层(上部)和L2衍生内层(A)。从左到右，每列对应于显微切割前的叶片截面(左)、目标组织与周围组织分离后的(中)和激光显微切割后的(右)。(比例尺：75μm。)。(C)在本研究的LM-RNAseq分析中，PCA确定了两个对应于叶8样本的发育阶段(PC1)和组织类型(PC2)的PC。每个点对应一个RNAseq样本。从左到右，每种颜色对应于一个特定的发育阶段(叶子的最年轻部分到最老部分)。从下到上，较深的色调表示L1派生的表皮组织(L1)，较浅的色调表示L2派生的内部组织(L2)。在间隔2中（橘黄色部分），去除一个离群值表皮样本。

2. 加权共表达网络分析筛选角质层生物合成的候选调控基因

研究者沿着表皮角质层成熟梯度查询不同阶段差异表达的基因，寻找在拟南芥中已知的角质层生物合成基因，以探究其关系。在大多数情况下，玉米呈现两个或多个与单个拟南芥角质层基因高度同源的重复位点。研究者使用基因共表达网络分析来确定与调节玉米角质层生物合成有关的其他候选基因。在WGCNA中，计算每个边(基因表达水平之间的相关性)以指示其与网络中的每个其他节点的共表达关系的强度。通过这种方式，基于本研究的激光微切割RNA测序(LM-RNAseq)分析，确定了所有11816个表皮转录基因的表达水平相关性，构建了WGCNA。

WGCN将出苗叶片8的转录组划分为21个共表达模块。图2说明了在所分析的七个叶片发育阶段中的每一个阶段，这21个模块中特征基因(理想化的代表性基因)的表达水平。主要的发展趋势如图2所示。模块F到I中基因的表达水平与蜡酯、角质和链长超过29个碳的烷烃的积累（图2绿色线）呈正相关。相反，包含模块L到O的转录本显示出从叶片近端到远端的积累水平递减，类似于C₂₁_:₀到C₂₉_:₀在展开的叶皮层中的碳氢化合物积累模式(图2玫红、蓝色线)。因此，转录物积累水平与每个近端叶片间隔的角质层脂质分布的比较(图2)揭示了有趣的相关性，清楚地识别了一组“未成熟”的角质层共表达模块(L到O)和“成熟的”角质层模块(F到I)。许多与特定角质层脂质谱正相关或负相关的模块包含已知的角质层生物合成和调控基因的转录本。例如，在模块F内， KCS6/CER6同系物AC233893.1_FG003和GRMZM2G060481与35:0烷烃的相关系数为0.95和0.81，而在模块H中发现的KCS1同系物GRMZM2G104626与烷烃31:0至35:0的相关系数>0.90。

图2 膨大的成年玉米叶片的近端远端转录梯度。研究者将角质、蜡酯和碳氢化合物(HC)等最主要角质层成分的积累变化与WGCNA中确定的21个模块的特征烯的表达水平进行了比较。此图上部转载自参考文献（R. Bourgault et al., Constructing functional cuticles: Analysis of relationships between cuticle lipid composition, ultrastructure and water barrier function in developing adult maize leaves. Ann. Bot. 125, 7 9–91 (2020).）已获得转载许可。

研究者采用了直接查询网络中已知角质层生物合成基因的“直接邻居”的方法，如对六个模块(A、C、F、H、I和Q)的分析表明，已知角质层基因转录本的富集。例如，几个已知在角质层生物合成中起作用的基因家族的转录本在模块F中过度表达，包括KCSs、ABC转运蛋白和LTPs，它们的直接邻居与这些角质层候选基因表现出很强的共表达，从而暗示了调节或协同调节作用。本研究总结了这些模块中已知角质层生物合成基因转录本的直接邻居，并包括参与调节正在展开的成年玉米叶片细胞壁修饰(包括角质层生物合成)的潜在候选基因。此外，在这些共表达模块中，表皮富集的转录本被过度表达。例如，在模块F内的972个基因转录本中，41.26%在表皮中上调，而所有11816个表皮转录基因中只有31.89%在表皮中上调。这一额外的空间过滤层进一步支持这些共表达模块和角质层生物发生之间的关联。由WGCNA实现的第二种基因发现方法是检查网络内的集线器，所述集线器被定义为对网络功能至关重要的连接最多的节点。在本研究中，与角质层成分显著相关的协同表达模块的中心通常是通过上述直接邻居方法识别的候选模块的子集。例如，在模块F中，许多枢纽也是来自KCSs、ABC转运蛋白和LTPs的基因转录本的直接邻居。这些枢纽中有两个是表皮中DE上调的基因。这些数据进一步支持了模数F，尤其是它的中枢在膨大的成年玉米叶片角质层发育过程中的重要性。表皮上调的角质层生物合成/调节候选基因中有11%在模块F中被发现。富集表皮上调候选的其它模块包括模块O(表皮富集候选的14%)、H(12%)、A(10%)、C(7%)、L(9%)、Q(6%)和T(6%)。角质层候选基因列表中还包括模块A、C和Q中的另外四个HUB基因。在本研究的WGCNA中，许多最初没有被识别为包含同源注释之后的角质层候选基因的额外枢纽被突出显示，从而提供了与角质层成分相关的潜在的新的候选基因。

3. 光调控角质层发育：光敏色素(PHY)突变体改变角质层组成

以前的研究表明，光照诱导陆地植物角质蜡的生物合成，暗生长植物中几种脂肪酸伸长酶复合体转录本的表达水平降低，从而减少角质蜡的数量。此外，生化分析还显示，在玉米叶片8(图2)的远端光照区间，较长链的蜡组分更为丰富。有趣的是，尽管陆生植物的藻类近亲不会形成角质层，但光照可以诱导藻类中的碳氢化合物从长链脂肪酸转化为碳氢化合物。共表达模块H(富含角质层基因的六个模块中的另一个)的GO分析表明，光响应转录本显著富集，包括五个光敏色素(PHYS；PHYA1，PHYA2，PHYB1，PHYC1和PHYC2)(图3A)。光敏色素是一种红/远红光可逆性染色蛋白，调节基因表达对光的响应。玉米含有6个PHY同系物(PHYA1、PHYA2、PHYB1、PHYB2、PHYC1、PHYC2)。本研究的WGCNA发现光感受器PHYB1和PHYA1是模块H(图3A)中的主要枢纽，而PHYA2和PHYC1包含的边缘要少得多。PHYB2转录本在玉米新出现的叶片8的内部组织层中被鉴定，而不是在表皮中；因此，PHYB2不出现在模块H中。以前在拟南芥中的研究揭示了非细胞自主的PHYB在整个植物发育过程中的功能，包括在开花时间、气孔发育和下胚轴向重力性的调节期间。PHYB1、PHYA1和 PHYA2转录本和模块H的积累一般与未成熟角质层中发现的碳氢化合物(烯烃和<C₃₁烷烃)呈负相关，未成熟角质层嵌入轮生层并被光屏蔽(图3B和C)。相反，模块H特征烯以及PHYB1，PHYA1和PHYA2的转录积累与成熟的角质层成分，如烷烃>C₃₁的蜡酯和角质单体(图3B和C)正相关。

图3 共表达模块与玉米成叶角质层成分相关分析。(A)模块H的共表达网络的可视化。红色节点对应于光敏色素同系物PHYA1、PHYA2、PHYB1和PHYC1，其中一些(PHYB1和PHYA1)占据网络的中心位置(与其他节点有许多连接)。(B)PHYA1、PHYA2和 PHYB1表达与角质层组分-蜡酯(WES)和脂类-之间的相关性(按链长分组)。(C)热图，描绘了展开的玉米叶片转录分析中确定的21个共表达模块(y轴)与每个角质层脂组分(x轴)的相关性。颜色(红到蓝)对应于皮尔逊成对相关的值，其中红(+1)是正相关，蓝(−1)是负相关。用于这项分析的角质层脂质丰度数据来自Bourgault等人的研究。

为了研究光敏色素在角质层生物发生中的可能功能，研究者对前面描述的玉米PHY突变体(在植物材料中描述)的第一个成熟阶段叶片中的角质层成分进行了化学分析。在玉米自交系W22背景下，分析了phyb1的3个预测零等位基因、2个phyb1 phyb2双突变体的等位基因组合和1个phya1 phya2双突变体，其中叶片9由第一片成熟叶片组成。在phyb1单突变等位基因中，叶片9中角质层成分没有明显变化。虽然先前的分析揭示了玉米中PHYB同源基因的一些亚功能化，但广泛的PHYB1和PHYB2幼苗和成熟植株的功能在遗传上是多余的。与野生型W22对照相比，phyb1-phyb2双突变体(即phyb1-phyb2-1和phyb1phyb2-2)的两个等位基因组合在叶9表皮中的总烷烃和总游离脂肪酸水平都有所增加(图4A)。C₁₆、C₁₈和C₃₆脂肪酸在phyb1、phyb2双突变角质层中都是过量的。更正要的是，在phb1phyb2突变体中，烷烃类C₂₃、C₂₅、C₂₇、C₂₉和C₃₇都显著增加(图4B)。然而，只有一个双突变组合phb1phyb2-2表现出显著增加脂肪醇和醛类的积累(分别增加了C₂₄到C₃₂和C₂₆到C₃₀种的水平)，尽管phyb1phyb2-1等位基因确实表现出类似的趋势(图4B)。这些结果验证了WGCN数据的预测能力，并表明PHYB介导的光信号可能具有抑制玉米成熟叶片轻质区特定角质层组分积累的功能。在phyb1phyb2双突变体中观察到的烷烃角质层组成的缺陷反映了当叶片从轮生中露出时角质层烷烃成分的变化(图2)。以上结果说明，在光照后，碳氢化合物从较短的碳氢化合物向较长的碳氢化合物转变，其中小于30个碳链的长度在暗暴露的叶间隔中占主导地位。PHYB1转录物积累与链长大于31碳的碳氢化合物呈正相关，而与较短的转录物(<31碳)呈负相关，进一步支持了PHYB介导的角质层组成调节模型(图2和3B、C)。

这两个玉米PHYA对偶基因表现出很大程度上重叠的转录积累模式和水平，这表明高度冗余的功能。尽管phya1 phya2双突变体只有一个等位基因组合可用，而且之前没有描述phya单突变体或双突变体的形态或发育表型，但气相色谱-质谱分析显示，与野生型叶片相比，phya1 phya2双突变体中总蜡酯的积累显著过量(图4C)。虽然醇、脂肪酸和烷烃的总量在phya1-phya2双突变体中没有明显的变化，但在双突变角质层中，较长链长的醇(C₃₂、C₃₄和C₃₆)、脂肪酸(C₃₀、C₃₂、C₃₄、C₃₆)和烷烃(C₃₇)过度积累，较短链长的醇(C₂₈)、脂肪酸(C₂₂和C₂₄)和烷烃(C₂₃、C₂₇₎在角质层中积累过多，而较短的链长的醇(C₂₂和C₂₄)和烷烃(C₂₃、C₂₇)则较少。对额外的phya1、phya2双突变等位基因组合的分析将有可能提供对PHYA功能调节玉米叶片角质层组成的模型的进一步测试,进一步支持本研究中WGCNA的预测(图3A)。

图4 光敏色素调节成年玉米叶片和小立碗藓的角质层蜡组成。(A)玉米phyB1、phyB2双突变体和对照叶片(W22)的主要角质蜡成分。(插图)总蜡载量。(B)玉米phyB1、phyB2双突变体和对照蜡中脂肪酸(FAs)和碳氢化合物(HCs)的详细组成。(C)玉米phyA1、phyA2双突变体和对照蜡中伯醇(PAs)、脂肪酸（FAs）和碳氢化合物（HCs）的详细组成。(D)PHY突变体和野生型小立碗藓配子体群体中的角质蜡轮廓。(插图)总蜡载量。误差棒表示SD。星号表示在非配对t检验中样本之间与野生型的显著差异。AL：醛；WE，蜡酯；ALIC，脂环类。*P<0.05；**P<0.01。

为了确定PHY对角质层积累的调节是玉米特有的现象，还是实际上在其他陆地植物中的普遍现象，在苔藓植物小立碗藓的PHY突变群落上进行了角质层脂质的等效分析。小立碗藓含有7个典型的PHY基因(PHY1-PHY4和PHY5a-PHY5c)，它们都缺少被子植物PHYB的N-末端延伸。此外，这些古老苔藓的PHY基因与被子植物的PHY基因在系统发育上处于不同的分支，在苔藓植物和被子植物中，PHY基因的复制和多样化是独立发生的。这些数据表明，小立碗藓的PHY基因可能具有独特的功能，这与被子植物PHY的不同。4个苔藓PHY基因座(phy1-4)的零突变是通过同源替换产生的。如图4D所示，对苔藓配子柄中角质层脂质的分析表明，与野生型苔藓相比，除phy1外，所有的小立碗藓phy单个突变体都表现出几个总蜡级的减少。具体地说，phy2、phy3和phy4突变体的总脂肪醇和总醛含量均显著降低，phy3和phy4的总烷烃减少，phy3的蜡酯减少，phy4的脂环和总蜡减少。此外，苔藓的phy2-4突变体表现出一些互补的表型。例如，phy3角质层缺乏长链(碳数≥25)醛，而phy4突变体缺乏短链(碳数≤26)醛成分。因此，小立碗藓中phy2-4突变体的角质层表型不等同于玉米中phyb1 phyb2或phya1 phya2双突变体的角质层表型，这可能是由于在这些胚生体谱系中PHY同源基因独立复制后，phy功能呈现多样化。

先前的研究表明，一些角质层生物合成基因的表达受光的诱导。在陆地植物的绿藻近亲中，光激活的光酶可以刺激脂肪酸转化为碳氢化合物，尽管这些脂质不会沉积在藻类表皮表面形成角质层。角质层是陆地植物的进化创新，而PHY光受体在包括淡水藻类在内的所有绿色植物中都存在，它调节植物生长发育过程中的各种生理过程。本研究来自苔藓和被子植物的数据表明，PHY介导的光信号作为陆地植物进化过程中的一种创新，有助于调节植物角质层的发育。

2 重磅综述 | Cell：非编码RNAs在肿瘤学中的作用（IF=36.216）

科研 | PNAS: 转录组学网络分析为玉米叶片表皮发育的调控提供了启示

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