科研 |NAT COMMUN：单细胞RNA测序鉴定通过双电位中间产物形成的早期感觉神经元的多样性
编译：胡胡，编辑：景行、江舜尧。
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躯体感觉是由多种初级感觉神经元的存在定义的，这些神经元具有独特的生物学特征以及对外部和内部刺激的反应特征。然而，关于细胞状态的多样性是如何在转录过程中产生的，目前还没有一个相对完整的概念。本研究使用深度单细胞RNA测序分析来解决小鼠感觉神经发生过程中的分裂和分子偏倚过程，结果确定了有丝分裂后神经元中一系列复杂的连续和特定的转录变化，这些变化描绘了导致主要感觉神经元类别产生的递阶调节状态。同时发现早期表达的亚型与本研究之前未被发现的基因型有关。总体而言，感觉神经元的早期多样性是通过连续的双电位中间产物产生的，其中相关基因模块的同步化和竞争性命运程序的同时抑制在细胞的稳定和最终分裂到分化之前。
论文ID
原名：Single cell RNA sequencing identififies early diversity of sensory neurons forming via bi-potential intermediates
译名：单细胞RNA测序鉴定通过双电位中间产物形成的早期感觉神经元多样性
期刊：Nature Communications
IF：12.121
发表时间：2020年8月
通讯作者：Louis Faure
通讯作者单位：奥地利维也纳医科大学脑科研究中心分子神经科学系
DOI号：10.1038/s41467-020-17929-4
实验设计
结果
为了获得小鼠胚胎发育期间从祖细胞向特定感觉亚型的谱系分裂图，研究进行了躯干的体感神经-神经胶质子代的单个细胞(祖细胞和神经元)的转录组。为此，研究者从小鼠品系中分离出树突状阳性(TOM+)细胞，其选择性地代表所有的神经干细胞(Wnt1CreR26tdTOM和Plp1CreERT2R26tdTOM)和神经元特异性Cre小鼠品系(Isil 1 core；r26 dtomandntk3cre；R26tdTOM)，以从E9.5、E10.5、E11.5和E12.5中获得体感神经元群体的富集(补充图1a，b)，并使用Smart-seq2方案(每个细胞检测到8070个基因的中值)对具有高覆盖率的单细胞的mRNAs进行测序(图1a和补充图1c，d)。
图1.正在发展中的体感系统的scRNA-seq和伪时分析。a.单细胞RNA测序数据集的UMAP嵌入表示，以胚胎日为注释；b .RNA速度载体投射到UMAP包埋上，表明分化方向性。用ElPiGraph在扩散空间上用半监督的方法推断的；c分化轨迹，显示了12个主要簇群，分别位于两个主轨迹（分支a和b）、10个分支和3个分支（1、2和3）。基因列表在源数据文件中提供；d.e使用pagoda2提取的最重要的生物学特性表明细胞状态从循环（Sox10+和Sox2+）到有丝分裂后细胞（d）以及从非神经元细胞到神经元细胞（e）（Isl1+和Tubb3+）；f.与GO术语“细胞迁移的正调控”（GO:0030335）相关的基因集的PC分数减去“细胞迁移负调节”的PC分数（GO:0030336），表明从迁移的神经嵴祖细胞向定居神经元群体的过渡；g.所选基因的UMAP图沿着轨迹分布，并在（c–e）所代表的细胞状态之间分布；h.神经发生过程中的转录组学动态和神经元特性表明，不同的状态解释了感觉亚类的分化，这些亚类可以根据神经营养因子受体和转录因子（Ntrk1、Ntrk2、Ntrk3、Ret、Runx1和Runx3）的特异性表达进行区分；i E12.5 DRG切片对（h）中突出显示的标记物进行免疫染色，表示轨迹终点和量化（n=3-5）。比例尺，20µm。数据以平均值±SEM表示；j.基于我们的scRNAseq数据分析的神经干细胞源于A支感觉神经元分化的层次分叉模型（根据面板h的颜色编码和聚类标识）。混合色方块反映了血统在相应的发展点上保留的潜在命运选择。
选择的阶段对应于感觉谱系发展的关键事件，从迁移的ncc（E9.5）开始，到第二波感觉神经发生的结束和神经元亚型的早期鉴定（E12.5）。数据集包含来自Isl1Cre的细胞；R26DTOMATE9.5和E10.5和Ntrk3Cre；R26DTOMAT E11.5和E12.5，这两条线都标记感觉神经元，Wnt1Cre；R26DTOMWAS用于标记NCC、E9.5和E10.5处的神经胶质和神经祖细胞，以及Plp1CreERT2；R26dtomatE12.5。用这些Cre系追踪后收集的细胞组合应提供完整的小鼠DRG神经祖细胞和早期神经元亚型的概要（FACS门控策略见补充图2）。
所有追踪策略的细胞的共嵌入没有基于追踪的批量校正，并导致不同追踪的细胞重叠，同时遵循发育时间轨迹和从祖细胞到特定神经元的进展（图1a-e和补充图1a、b；轨迹见下文）令人信服地验证了数据集用于进一步计算分析的使用。
首先将数据集投影到扩散空间以去除底层几何体的噪声，并且借助聚类结果，使用elpigraph以半监督的方式拟合了主树（图1b，c）。捕获了树根种群和端点以及中间状态作为子簇，从而确定了两个主要的神经源性轨迹，即分支A和分支B（图1c）。这些分支是从祖细胞到有丝分裂后新生神经元的明显转变演变而来的，这是用Pagoda2（图1d，e）确定的。Pagoda2将谱系树分为两种主要状态，即循环（Sox10+和Sox2+）与非循环（Isl1+），对应于非神经元和神经元群体，后者由轴突相关细胞骨架和功能基因（包括Tubb3，编码βIII微管蛋白）的特异性表达来定义（图1d，e）。一直以来，SOX10+电池合并EdU（循环细胞），且不与有丝分裂后神经元标记物ISL1共定位（补充图3a）。βIII微管蛋白染色标记感觉神经元，与同样为EdU+的SOX2+细胞不共定位（补充图3b）。细胞迁移GO-term基因集的阳性（GO:0030335）和阴性（GO:0030336）调控的PC评分显示从迁移的ncc向神经元祖细胞的转变（图1f）。微环境，包括整合素亚单位，与细胞外基质动态结合和相互作用的主要受体，它代表了运动细胞的一个必要特性（补充图3c）。神经祖细胞和神经元是由促进细胞间粘附的钙粘蛋白基因表达的转换来定义的（补充图3d）。发现揭示了与迁移前体和迁移后神经元祖细胞相关的细胞粘附性变化的一般原理和分子途径。
祖细胞中，A支和B支分化成终末神经元簇，E12.5表达主要早期DRG神经元群的分子标记：本体感受型、机械感受型和伤害性群体。本体感受谱系在E12.5处的特征是Ntrk3（编码TRKC的Ntrk3）与Runx313–15共表达，而机械感受神经元表达Ret和Ntrk2（Ntrk2编码TRKB）（图1g–i和源数据文件）。B分支分化为伤害性Ntrk1+（TRKA）细胞，其特征是Ntrk1的表达（以及TRKA+细胞中Runx1的开始诱导）（图1g–i），这是伤害性谱系5的一个特异性标记。上述群体标记的组合使用涵盖了该阶段所有（ISL1+）19个感觉神经元（图1i）。
通过代表早期感觉神经元的主要类别，研究者的数据集和分析产生了体感神经元多样化树的精确顺序，其中祖细胞经历了快速的转录变化，这些变化通过逐步分支点和离散的感觉神经元状态进行，符合不同神经元类型出现的发展顺序（图1j）。
2 干细胞群和感觉神经发生波
在神经嵴迁移期间，连续的祖细胞池依赖于NGN2或NGN1产生第一波的大尺寸神经元(主要是TRKC+、TRKB+和RET+神经元)，然后分别产生第二波神经发生的小尺寸TRKA+神经元。第三波神经发生来自边界帽细胞(基底细胞，也来源于神经细胞)，主要产生小体积的TRKA+神经细胞。该领域的一个主要问题是细胞在神经发生过程中如何从一种状态发展到另一种状态，以及神经发生程序如何指定导致特定神经元亚型的神经发生的两个主要波。为了解决这些问题，研究者首先确定了不同的细胞群和轨迹。在本研究的数据集中，定义分化树起源的聚类1-3（循环细胞）显示剩余神经板边界基因（如Zic和Msx，仅在集群1的少数细胞中发现），NCCs说明符的上调(Sox9、Foxd3和Ets1)和参与NCCs迁移的基因的表达(Cdh11和Itga4，后者在簇2和3之间的桥中高度表达)（图2a，b）。此外，随着RNA速度流，簇2和簇3开始表达原神经发生标记（Neurog1和Neurog2）（图2c），将这些群体定义为神经祖细胞。研究者将这三组标记为早期NCC（聚类1，顶部差异表达基因（TDEGs）；Prtg、Crabp1、Snai1和Dlx2）、晚期NCC（lNCCs，cluster 2，TDEGs:Hoxd10、Hoxd11、Hoxa11和Hoxc12）和LNCC/BCCs（聚类3，TDEGs:Fabp7、Sparc、Serpine2和Ednrb）（图2a，b)。
测序数据的比对显示出两条轨迹（或分支）从高度异质的簇NCC和LNCS/BCCs中出现导致神经发生，将其命名为分支A和分支B，（图2c）。分析还表明，虽然来自lNCCs/BCCs的神经祖细胞只表达Neurog1，但不能根据其特定的NGN表达来区分两个主要的神经发生轨迹（分支A和B，图2c）。事实上，在这两个分支中，前体细胞从Neurog2+进化到Neurog1+状态（图2d），大量单个细胞同时表达这两种转录物（图2e–g）。NGN2和NGN1在神经发生的第一波和第二波中分别有特定的表达。在这两个小鼠中，在所有类别的DRG神经元中都观察到重组（TOM+），不管它们的神经发生波（图2h-l），确认了最近一项研究的结果。大多数感觉神经元前体细胞在两个基因共同表达的中间状态下依次表达Neurog2和Neurog1，并提示产生第一波或第二波神经发生的神经元前体适时地倾向于优先需要NGN2或NGN1作为神经元区别。
图2.神经嵴干细胞群和感觉神经发生波。a.b： NCCs异质性由不同的循环细胞簇（1−3）（a）（图1d）定义，这些细胞群由标记物的特异性表达标记，并描绘出早期神经嵴细胞（eNCCs）、晚期NCCs（lNCCs）和边界帽细胞（lNCCs/BCCs）（b），（b）中的RNA速度显示了从eNCCs到lNCCs，然后到lNCCs/BCCs的定向转录流。lNCC和lNCC/BCC的一些细胞聚集到神经源性状态（粉红色）；c.d：用RNA速度计算分析神经源性小生境，显示主要神经源性转录因子Neurog2和Neurog1的顺序表达； e：在E10.5DRG切片上对Neurog1和Neurog2进行RNAscope染色，证实它们在同一祖细胞中共表达。比例尺，10µm；f. Neurog1和Neurog2的单细胞值图显示，在E10.5假时间之后，祖细胞中存在三个阶段，包括Neurog2和Neurog1在单细胞水平上的同时表达（虚线内，136个细胞）；g：神经元前体细胞中伴随的平均表达的定量反映了从Neurog2高表达到低表达和Neurog1从低到高的动态表达范围。数据以最小至最大触须图的形式呈现，中心点为平均值；h：来自Neurog2Creer2的E18.5 DRG的横截面图；在E9.5和E10.5处用三苯氧胺注射的R26dt显示来自两个神经发生波（分支A和B）的神经元中的重组，如TOM在大直径神经元和小直径TRKA阳性神经元（星号）中的表达所示（箭头指向TRKA+/RFP−细胞），比例尺，20µm；i–k.每只动物分析533个TOM+细胞（i–k，n=4）。在RFP+神经元中，半数以上为TRKA阳性（j），直径小于或等于15μm（k）。比例尺，50µm。数据表示为平均值±SEM；l：类似于（h），使用Neurog1Cre；R26tdTom（n=3）；m：鉴定A支和B支之间表达的共同转录组程序，导致所有感觉神经元（n）；o：产生A支神经元（有髓，大直径）或B支神经元（无髓，小直径）的特定基因模块；p：转录因子活性推断显示预测分支特异性活性。
3 有髓和无髓神经元的神经发生。
研究者分析了有髓和无髓神经元分化的发生和关键分子决定因素。为此，使用扩散图来计算比较两种神经发生轨迹，即分支A和分支B（图2m），推断出一个公共点，表示扩散空间中两个分支最接近的位置（图2n）。在Sox10表达之后，Neurog2接着是Neurog1，然后是Neurod4、Pou4f1（BRN3A）、Neurod1和Isl1。两个主要轨迹共有的聚合基因定义了一个通用的感觉分化程序（图2n）。常见的基因包括Neurod1和Neurod4，它们是保守的原发性转录因子，以及Sox2和Sox5，它们代表了先前未描述的发现，可能在体感系统的发育中起到特定的作用（图2p和补充图2）。同时，不同的基因特定于任何一个轨迹区分有髓谱系（A支）和无髓谱系（B支）（图2o）。具体而言，发现Nfia、Gli2和Neurod2参与B支（图2o和补充图2），表明不同的TFs在A支和B支的感觉神经发生过程中起着关键作用。研究者检查了转录变化的过程和代表神经元亚型多样化事件的分支点，重点分析了沿着分支A的三个下游分支（图3a）。每一个分叉可分为三个中间阶段：分叉前（根）、分叉点和分叉后的轨迹部分（图3b）。分叉前和分叉后阶段分别揭示了导致命运选择及其巩固的转录变化动态。在分支A中，第一个分支对应于机械感受器和本体感受器之间的二元细胞命运选择（图3b，c）。研究者确定了两个主要的早期基因模块，与分叉前阶段（图3d）的固有感受器（45个基因）或机械感受器（60个基因）的命运分裂有关，以及定义细胞承诺的晚期基因模块（图3e）。当细胞在假时间轴上生长时，发现这两个基因模块最初在单个细胞中共同表达，然后逐渐相互排斥，走向与命运选择偏好相关的分叉点（图3d）。a -纤维低thresold机制受体分化轨迹的第二次分叉代表了仅Ntrk2和Ntrk2/Ret之间的命运选择(图3f-h)。模块决定他们的命运分裂偏向Ntrk2或Ntrk2/Ret群体(图3i, j)显示轴突引导受体活性(GO:0008046)对Ntrk2只有命运的富集。
有髓谱系早期细胞内的这些早期模块之间存在竞争，这可能导致将来的命运分裂偏向于机械感受器或本体感受器（分支1，图4a）（或朝向触觉机械感受器的两个不同亚群分叉2，图4b）在实际分裂发生之前（图4a，b）。这些早期偏压模件在分叉前最初在单胞水平上局部呈现正相关（图4a，b，模内，见箭头），并且在分叉前阶段呈现出模间负相关的增加（图4a，b，c），因此，建议在命运承诺之前共同激活竞争偏倚程序（图4c-f）。因此，保留下来的程序将参与一种细胞类型与另一种细胞类型命运的展开。
图3.沿分化轨迹定义命运选择和承诺的基因模块的表达。a.UMAP嵌入的分支分析综述。b分析代表本体感受器和机械感受器谱系之间命运选择的分歧（图1c的分支8和9）；c.UMAP图显示机械感受器和本体感受器谱系标记的表达，并在体内验证（见补充图3）；e散点图显示机械感受器和本体感受器模块沿着机械感受器和本体感受器谱系在每个细胞中的平均表达。早期竞争模件（d）表现为逐渐的共激活，随后选择性上调一个命运特异性模件，下调另一个命运特异性模件。后模（e）在分叉后，在本体感受器和机械感受器中表现出几乎互斥的表达，反映了对任何一种命运的承诺。颜色代码如（a）所示。前十个差异表达最高的基因，以及转录因子（TF）；f.代表Ntrk2和Ret/Ntrk2谱系之间机械感受器命运选择的分叉分析（图1c的分支10和11）。g.h分支的体内验证，Anxa2表达Ntrk2命运，Grik1表达Ret/Ntrk2命运（n=3只动物）。比例尺，10µm；i.j散点图显示Ntrk2和Ret/Ntrk2模块在两个机械感受器亚系中的平均表达。早期的竞争模块（i）表现出逐渐的协同激活，然后选择性地上调一个命运特定的模块和下调另一个命运特定的模块。后模（j）在分叉后的两个机械感受器谱系中几乎相互排斥表达。颜色代码如（a）所示。前十个差异表达最高的基因，以及转录因子（TF）。
图4.早期的命运决定基因或模块显示了在细胞命运选择过程中逐渐的模块内协调和模块间排斥。a.b对于分支1和分支2，假时间分析中的图显示了分支特定模块内和之间的基因平均局部相关性，每个模块内的协调性逐渐增加，分支特定模块之间的拮抗表达增加；c.d在一组发育时间相似的细胞中（用黑点标记），两个分支的模块基因与分支特异的早期基因模块的平均局部相关性。模块内和模块间相关性之间的差异，表征了交替模块之间的拮抗表达程度，显示在相关图的右上角，并以（d）中的图表表示为Y轴上的绝对值，该值将反映模块之间的排斥；e.感觉神经元二元命运决定示意图；f.两个分支的基因模块排斥作用在不同的假时间t达到峰值。
4 体内细胞命运偏向程
为了研究早期基因模块中的TFs如何影响体内的命运选择，研究者集中于RUNX 3的作用，该作用在本体感受器/机械感受器轨迹的分叉前阶段在部分感觉神经元中表达，并且在分叉后的所有本体感受器中都存在（图3c，d，5a，b）。使用Runx3-/-; Bax-/-动物，其中Bax的缺失使得可以在不存在细胞死亡的情况下研究RUNX3的功能，我们观察到E12.5 DRG中TRKB +细胞的比例增加了三倍（图 5c），类似于先前的结果。在缺少Runx3的GFP +细胞中，前本体感受器决定中鉴定的大量前耳基因和晚期基因被显着下调（即Runx3，Fam19a4，Cntnap2，Shisa6，Anxa2，图5d，蓝点），而某些被鉴定为前体感受器的基因则显着上调。（即Ntrk2，Gfra2，Pou6f2，Gpm6a，Plxna2，图5d，红点），表明在感觉神经元多样化期间，在细胞命运选择之前存在竞争的遗传程序。
5 神经元分化过程中转录程序的融合
本研究最后的研究是定义最不同的簇的具体特征，轨迹的端点(图6a)。数据显示，成熟为不同的神经元类型时，又在转录水平上重新聚合，根据分析的终点神经元类型之间的转录异质性相对较少（图6b）和GO项类别的高度重叠（图6c）来判断。分析可以在构成分支A和分支B轨迹端点的簇间识别出大约120 - 180个差异表达基因(图7)。其中一些基因是亚群特有的标记（图6a）。E12.5处表达的与神经元功能相关的基因模块（图6d，e）。在E12.5，研究人员发现44个基因从有丝分裂的神经元祖细胞传递到所有有丝分裂后的感觉神经元，这些基因编码决定神经传递表型和神经元特有的形态学特征（最具代表性的GO术语：轴突神经元投射、髓鞘和细胞投射）（图6f），这些基因在多样性树的各个层次上都得到了保留，并且在成人的感觉神经元中仍然发现了这些基因由三个子单元组成：外周感觉神经丝神经元、外周感觉非肽能神经元和外周感觉肽能神经元（图6g，h）。因此，本研究的数据提供了一组定义从感觉祖细胞到成年感觉神经元的整个感觉谱系的基因（图6i）。
讨论
调节体感神经元命运的分子机制尚未完全了解，这主要是由于特定的挑战，包括相对快速的神经发生过程，以及在感觉神经节结合的位置大量混合祖细胞和细胞类型。本研究对哺乳动物体感系统中的神经发生进行了全面的基于scRNAseq的分析，并确定了独特的和混合的谱系转录组状态，这些转录组进化到特定的神经元亚型（图7）。此外，研究提供了一个早期发育动态的分析，揭示了早期体感神经元的出现。确定了一个组合过程，通过这个过程，细胞类型特异性神经元身份出现，并揭示了在导致具体感觉亚型的多样化树中的命运分支点之前，早期分裂的祖细胞和神经元的异质群体中先前的命运相关变化。循环细胞之间导致神经元多样性的二元决定在发育早期祖细胞不对称分裂或前体谱系前模式的背景下被大量描述.数据显示，新生的感官在一个轨迹内的神经元来自一个相对同质的细胞群体，神经元的分子特异性是通过一系列连续的二元决策沿着伪时间轴逐步获得的。在胚胎后期体感发育过程中，例如在TRKA+/RUNX1+伤害感受器分化为肽能和非肽能的感觉神经元群的过程中，已经有人提出了通过相互抑制活动进行分支分离的概念，然而,时机和基因调控策略,调节分化过程仍然知之甚少。
数据表明，在发育中的神经系统中，早期神经元类型的命运分布机制，即有丝分裂后神经元群体的命运偏倚异质性逐渐增加，直到二元决策的确定点。类似于多能干NCC谱系树的其他命运形成过程。分叉事件的分子基础沿着体感发展的层次决策树揭示了在分叉之前细胞中双电位转录状态的初始共激活，随后逐渐向细胞命运承诺和二元决策转变。因此，在早期发育过程中，通过增加相关程序的同步性（作为关键的谱系启动因子）以及同时抑制竞争性命运程序来实现对特定感觉神经元命运的确定。补充了早期细胞状态分离和细胞命运鉴定。虽然基于祖细胞命运限制性TFs的限制性神经元表达（以开关模式）已在二元命运选择的控制中得到了很大程度的证明，但是转录事件的序列以及在神经元多样化过程中运行的分子机制一直很难理解。然而，复杂的神经元多样化程序可能被认为是随着时间的推移而整合的多个二元命运决定的集合。因此，本文提出的神经元发育过程中转录谱动态的高分辨率分析可以为进一步研究神经系统其他部分如何产生神经元多样性提供分析基础。
分析还补充了最近发表的一项研究，该研究展示了体感神经元在胚胎和出生后发育的各个阶段的转录谱。数据证实了早在E11.5岁时DRG中神经元异质性的研究结果，该阶段有明确定义的本体感受器和触觉机械感受器群体。研究主要集中在不同的方面，大量细胞的分析提供一个详细的感觉细胞类型的发育转录图谱，并在较少的早期时间点上，提供了一个导致感觉神经元多样性早期出现的分子事件的机制性见解。
体感系统内产生的感觉神经元和细胞类型比例相对恒定的镶嵌分化模式使其不太可能受到纯粹确定性机制的限制，相反增加了未成熟神经元中随机命运决定的可能性，其中一个二价分子程序将趋于稳定，从而逐步驱动两种可能的命运之一。在系统中，在本体感受器和机械感受器谱系之间的决定过程中，需要高水平的RUNX3表达来确定本体感受的命运。Runx3在未成熟神经元亚群中异质表达的机制仍需进一步研究。观察上游机制是否以及如何严格控制各种启动子和调控元件的活性，这些启动子和调控元件特别是在假定的本体感受器谱系中促进Runx3表达的活性。通过整合多个细胞识别调控步骤，这种沿着层级分化树运行的机制可以帮助确保从一个共同的祖细胞库发展而来的所有神经元亚型的正确表达，特别是通过影响命运选择动态。
总之，该研究提供了一个神经发生和感觉神经元发育的详细转录路线图，它捕捉了参与细胞命运选择的分子事件的动态，并通过感觉神经元的分叉和谱系规范进行了进展。研究者确定了基因模块的动态爆发，这导致了谱系内的分支点（图7）。识别使感觉神经元产生特定命运的基因模块可能有助于工程化多能干细胞和胚胎干细胞技术，并有助于提高他们设计特定神经元群体的能力，用于基础研究、组织再生或筛选抗神经退行性变或神经变性药物疼痛障碍。此外，这可能有助于破译TFs的组合密码，并在细胞内稳态丧失的情况下操纵它，以助于细胞恢复到健康状态。
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