《自然》子刊：我们对阿尔茨海默病了解得太少了！科学家揭示AD的异常磷酸化蛋白网络，或找到未知的独立组...
随着各类生物组学的迅猛发展，磷酸化蛋白组成为了理解磷酸化激酶网络的重要手段。
在阿尔茨海默病（AD）病理研究中，细胞信号传导无疑是重要内容之一，其中广为人知的就有磷酸化信号通路。遗憾的是，一直少有相关的磷酸化蛋白组分析。
近日，由麻省理工学院Forest M. White带领的研究团队在Nature Aging发表重要研究成果[1]，弥补了这个缺失。
研究人员选取AD病人及同年龄正常对照的颞叶皮层组织，通过质谱（MS）分析了蛋白质组和酪氨酸（Tyr）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）磷酸化蛋白组，发现了与磷酸化tau蛋白水平，及AD病理阶段相关联的激酶肽段、新的磷酸化位点及信号分子，对于人们理解AD病理过程的复杂性和开发新治疗靶点具有重要意义。
论文首页截图
人们已经发现，β-淀粉样蛋白斑（Aβ）是AD早期特征之一，随后是超磷酸化微管结合蛋白 tau（MAPT）的积累，最终产生神经退行[2]。在整个AD的发展过程中，蛋白质磷酸化信号介导了细胞内Aβ 和MAPT的毒性积累以及其他应激反应[3]。
早期研究中已经发现多种有关MAPT磷酸化或加速积聚的激酶（例如GSK3β, CDK5, PKA, CaMKII, Fyn, BRSK, MARK, MAPK等[4-6]），还有一部分动物模型试验显示，靶向调控细胞磷酸化信号能够对AD的治疗产生积极效果。
然而，一直很少有研究利用磷酸化蛋白质组学来分析与AD各发展阶段对应的特定信号传导事件。之前有研究分析了AD死亡患者脑组织中丝氨酸/苏氨酸（pSer/ pThr）磷酸化蛋白组和常规蛋白组，但其中存在巨大缺陷：一方面其磷酸化蛋白组缺少重要的酪氨酸位点（pTyr）和很多已知的激酶，另一方面病人样本量很小甚至混合在一起。
与Tau或少突胶质细胞群有明显关联的所有具有磷酸肽的激酶的基因组图
Forest M. White研究团队则完善扩充了测定的磷酸蛋白组，并充分分析了其与MAPT磷酸化、细胞特定类型标记和临床组织病理学参数的关系。
White团队的研究样品来自25名AD病人和23名作为对照组的正常人（ND）。研究者共鉴别并量化了88419 种多肽，其中1.5% 含有pTyr，16% 含有pSer/pThr。
这些多肽中的58%存在于至少15 份样品中，仅该部分数据被用于后续分析，以确保可信度。研究人员在利用实验数据构建出与每个病人相对应的多肽相对含量矩阵后，接下来就可以通过多种无监督学习算法进行探索性分析了。
首先，研究者们对全部48份样品、8706种多肽进行k-均值聚类分析，以寻找具有相似调控变化的多肽组。在设定阈值后进一步人工筛除特征冗余或信息过少的类， 最终选取了可以解释73%总方差的6个多肽类（cluster），分别命名为Tau, Oligo, Astro, Micro, Neuro, pNeuro。
研究流程
借助AD病人大脑皮质单核RNA测序数据，可以将每种多肽对应到其特征性富集的细胞类型。分别统计6个类中所有的“多肽-细胞”对应关系，研究人员发现了和整体相比差异显著的细胞组成。（图1 左）
通过计算聚类中心之间的皮尔逊相关系数，研究者们发现：Tau和Oligo是相互独立的（相关性约为0）。Astro和Micro之间呈明显正相关，且分别与Tau和Oligo正相关。Neuro与Micro之间呈现很强的负相关，表明小胶质细胞活化和神经元突触减少在AD中有一定联系 。（图1 中）
同时，研究者们开始探究各聚类中心与AD病理的关系。通过接受者操作特征曲线（ROC curve analysis）可以看出， Tau是AD的最佳预测变量。（图1 右）
图1 左：6个类中包含的多肽富集于不同类型的细胞。中：6个聚类中心之间的皮尔逊相关系数。右：ROC曲线中最下方的Oligo是区分AD和ND的最佳预测变量。
对于该类高维度数据，为了消除变量相关性带来的复杂影响，以及数据可视化，通常可以进行主成分分析（PCA）降维处理。
在该研究中， 当Tau的聚类中心值随坐标轴PC2方向变化，Oligo随坐标轴PC1方向变化，即这两个类与最大方差的方向一致时，数据得以保留最多的信息。
通过聚类中心在两个主坐标轴上投影值的正负，样本数据可以分为以下四组：Tau−/Oligo−, Tau /Oligo−，Tau−/Oligo 和Tau /Oligo 。（图2）其他坐标轴组合，例如Astro;Micro 或pNeuro;Neuro， 都不能有效区分AD和ND。
经分析，Tau ;Oligo−代表了AD早期阶段，Tau ;Oligo 则可能代表具有神经末梢退化和神经胶质增生的晚期阶段。有趣的是，Tau包含的成分基本在当前AD 神经病理学中得到了研究，但Oligo中的分子却鲜为人知，很可能预示着组织病变过程中未知的独立阶段。
图2: 所有样本可根据Tau和Oligo有效区分
接下来，研究者们将目光转向不同激酶的磷酸化位点、磷酸酶以及受体信号分子。由于Tau和Oligo相互独立，可以作为主坐标轴，用于计算每种激酶与这两个聚类中心的斯皮尔曼偏相关系数，从而反映每种激酶与病程早期或晚期的相关性。
研究者重点选取了以下两组与AD有关的激酶：第一组为超磷酸化微管结合蛋白 tau（MAPT）激酶，第二组为周期蛋白依赖性激酶（CDKs ）。
分析发现，磷酸化位点TNIK pS680, BRSK1 pS443 和 BRSK2 pS423 的上调与Tau 样本对应，磷酸化 CDK5, CDKL5, CDK16, CDK17 和CDK18则与Tau和Oligo都相关，在Tau ;Oligo 样本中均显著上调。（图3）
图3: MAPT激酶和CDK与Tau和Oligo的偏相关系数
自然而然地，研究者们希望知道具体有哪些多肽最能预测AD病理。因此他们通过构建一系列多变量偏最小二乘（PLSR）模型和隐变量模型，将每种肽段和AD的相关性排序。主要发现有：
在pTyr peptides 数据中，CKB pY39 与AD有最强相关性。有研究发现AD病人大脑存在局部肌酸积累，肌酸激酶B活性下降[7] （图4 左）。
在pSer/pThr peptides数据中，MAPT的磷酸化位点与AD有最强相关性，其中包括MAPT pS579, pS713和pT534。同时Paralemmin-1 (PALM) 的磷酸化位点pT141 和pT145 也与AD强相关，但其具体机理尚不明确。聚类属于pNeuro 的CAMKK1 pS52 和CASKIN1 pS935则与AD呈最强的负相关关系（图4 中）。
在蛋白组数据中，EMILIN3和补体蛋白C4A 与AD病理有最强相关性。EMILIN3 仅特异性发生于Tau 样本，但尚不清楚其在大脑或AD中的作用。C4A是一种炎症标记分子，有研究认为它可以调节小胶质细胞吞噬突触及其碎片 [8]（图4 右）。
图4 部分多肽被高亮，颜色依据特征性富集该蛋白的细胞类型。绿色为星形胶质细胞，蓝色为小胶质细胞，黄色为神经元
总而言之，本研究一方面印证了大量已知与AD相关的蛋白或磷酸化蛋白，另一方面揭示了多种新的与AD不同病理阶段相关的标记蛋白及信号分子 。尤其是与AD早期相关的信号传递通路，有望成为治疗或减缓疾病进程的新靶点。
参考文献：
[1] Morshed, N., Lee, M.J., Rodriguez, F.H. et al. Quantitative phosphoproteomics uncovers dysregulated kinase networks in Alzheimer’s disease. Nat Aging 1, 550–565 (2021). https://doi.org/10.1038/s43587-021-00071-1
[2] Musiek ES, Holtzman DM. Three dimensions of the amyloid hypothesis: time, space and 'wingmen'. Nat Neurosci. 2015;18(6):800-806. doi:10.1038/nn.4018
[3] De Strooper B, Karran E. The Cellular Phase of Alzheimer's Disease. Cell. 2016;164(4):603-615. doi:10.1016/j.cell.2015.12.056
[4] Long JM, Holtzman DM. Alzheimer Disease: An Update on Pathobiology and Treatment Strategies. Cell. 2019;179(2):312-339. doi:10.1016/j.cell.2019.09.001
[5] Cavallini A, Brewerton S, Bell A, et al. An unbiased approach to identifying tau kinases that phosphorylate tau at sites associated with Alzheimer disease. J Biol Chem. 2013;288(32):23331-23347. doi:10.1074/jbc.M113.463984
[6] Jicha GA, Weaver C, Lane E, et al. cAMP-dependent protein kinase phosphorylations on tau in Alzheimer's disease. J Neurosci. 1999;19(17):7486-7494. doi:10.1523/JNEUROSCI.19-17-07486.1999
[7] Aksenov M, Aksenova M, Butterfield DA, Markesbery WR. Oxidative modification of creatine kinase BB in Alzheimer's disease brain. J Neurochem. 2000;74(6):2520-2527. doi:10.1046/j.1471-4159.2000.0742520.x
[8] Sellgren CM, Gracias J, Watmuff B, et al. Increased synapse elimination by microglia in schizophrenia patient-derived models of synaptic pruning. Nat Neurosci. 2019;22(3):374-385. doi:10.1038/s41593-018-0334-7
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