无论生老病死都只关心你一个

于2019年1月发表在《Immunity》杂志的文章，标题是：《Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes》

链接是：https://doi.org/10.1016/j.immuni.2018.11.004

这个文章很有意思：Here, we analyzed the RNA expression patterns of more than 76,000 individual microglia in mice during development, in old age, and after brain injury.

也就是说，研究者在单细胞水平探究了小鼠生老病死的microglial细胞情况，挑选出来microglial细胞的策略是：Microglia were then FACS purified using the markers CD45, CD11b, and Cx3cr1 ，示意图如下所示：

 

以前粗糙的分类

Despite the morphological diversity present among microglia in development, health, injury, and disease, microglia have historically been characterized as “resting,” “M1” (proinflammatory), or “M2” (anti-inflammatory) based on simple in vitro stimulation methods.

也就是说这个microglia在生老病死的各种情况下，其实形态上会有很大的变化，但是以前我们只能说区分处理 “resting,” “M1” , or “M2” 这3种，其实是远远不够的。所以研究者们做了单细胞转录组测序，拿到了76K个单细胞，对microglia 这个细胞群进行细分亚群。

数据在GEO

链接是：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE121654

GSM3442006 E14.5 female no 1
GSM3442007 E14.5 male no 1
GSM3442008 E14.5 female no 2
GSM3442009 E14.5 female no 3
GSM3442010 E14.5 male no 2
GSM3442011 E14.5 female no 4
GSM3442012 E14.5 male no 3
GSM3442013 E14.5 male no 4
.....

第一次降维聚类分群：

 

这个76,000细胞数量在2019年初可能还行，现在基本上10个10x样品就OK了。

上游分析仍然是传统的10x仪器御用cellranger流程

Sequenced samples were processed using the Cell Ranger 1.2 pipeline and aligned to the GRCm38 (mm10) mouse reference genome. For each sample a digital gene expression matrix (DGE) was generated containing the raw UMI counts for each cell in a given sample.

现在cellranger流程已经进化到V6了，我们也是在单细胞天地公众号详细介绍了cellranger全部使用细节及流程，大家可以自行前往学习，如下：

但是这个3年前的系列笔记是基于V2,V3版本的cellranger，在2020的7月我看到了其更新到了V4，也里面写了一个总结，见：cellranger更新到4啦（全新使用教程），后面的V5,V6我基本上都是马上就更新教程，不过这些教程其实大同小异啦，还是推荐大家直接看官网文档。

下游分析

起初文章自己的数据整合并没有使用seurat，而是 independent component analysis (ICA) based platform, as described in (Saunders et al., 2018)，但是后来它结合了公共数据的时候，又使用了CCA算法。见：To perform a more direct comparison between the pathological microglia (DAM and IRM), we used canonical correlation analysis (CCA) (Butler et al., 2018) to account for differences between the single-cell platforms (10x Genomics versus Marsseq).

其实这样的单细胞转录组测序整合算法超级多，我想你应该是不会一一细看的，我就列出来而已：

  • MNNcorrect (https://doi.org/10.1038/nbt.4091)
  • CCA + anchors (Seurat v3) (https://doi.org/10.1101/460147)
  • CCA + dynamic time warping (Seurat v2) (https://doi.org/10.1038/nbt.4096)
  • LIGER (https://doi.org/10.1101/459891)
  • Harmony (https://doi.org/10.1101/461954)
  • Conos(https://doi.org/10.1101/460246)
  • Scanorama(https://doi.org/10.1101/371179)
  • scMerge(https://doi.org/10.1073/pnas.1820006116)

大家看到最多的其实是CCA + anchors (Seurat v3)，这也是我的教程里面经常出现的。参考前面的例子：人人都能学会的单细胞聚类分群注释  ，多个单细胞对象的整合，这里直接使用标准CCA + anchors (Seurat v3)代码即可：

pro='integrated' 
for (i in 1:length(sceList)) {
  sceList[[i]] <- NormalizeData(sceList[[i]], verbose = FALSE)
  sceList[[i]] <- FindVariableFeatures(sceList[[i]], selection.method = "vst", 
                                             nfeatures = 2000, verbose = FALSE)
}
sceList
sce.anchors <- FindIntegrationAnchors(object.list = sceList, dims = 1:30)
sce.integrated <- IntegrateData(anchorset = sce.anchors, dims = 1:30)

感兴趣的可以下载数据， 走一下：人人都能学会的单细胞聚类分群注释  ，看看能不能得到文章里面类似的亚群。

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