磷酸化多肽的富集原理及相关富集方法研究进展

磷酸化多肽的富集原理及相关富集方法研究进展

由核酸经转录翻译后形成的前体蛋白质通常是没有活性的，往往需要再经过折叠、修饰等过程才能赋予蛋白质正常的活性及相应的功能。磷酸化是真核生物细胞内最普遍、最重要的蛋白质翻译后修饰之一，其几乎参与调节了生物体内所有的生命活动。正因为磷酸化有着复杂且广泛的生物学意义，全面解析磷酸化修饰已成为当今生命科学领域的重要任务之一。

尽管磷酸化修饰在生物体内分布非常广泛，但磷酸化多肽在总酶切多肽中的占比并不高，据推测可能不足5%。建立高效的富集方法是实现高通量磷酸化修饰分析的关键环节，也是蛋白质组学领域中一项颇具挑战的任务。当前常用的富集方法主要分成三类：免疫印迹法、金属氧化物亲和色谱(Metal Oxide Affinity Chromatography, MOAC)法、固定化金属亲和色谱(Immobilized Metalion Affinity Chromatography, IMAC)法。近十多年来，一些基于新型材料的富集方法也逐步被应用到该领域中。在汉斯出版社《分析化学进展》期刊中，有学者重点总结这些材料的富集原理及相关方法的研究进展，期望能为开发磷酸化肽富集技术提供有意义的信息。

就富集原理而言，MOAC与IMAC法主要通过金属离子与磷酸基产生相互作用，从而较为特异性地捕获磷酸化肽；新型材料则主要依赖于某些官能团，其可通过离子交换、、疏水作用等方式与多肽产生相互作用。

经典IMAC材料固定的金属离子密度不高，因而不易实现磷酸化多肽的高效率富集，并且普遍存在金属离子丢失等问题，于是，用有正电荷属性的官能团代替金属离子成为不少新型材料的设计思路。一方面，在酸性不是很强的情况下氨基即可被质子化，而此条件下磷酸基往往仍然呈现负电荷状态，两者之间存在异性电荷吸引力；另一方面，磷酸基中含孤对电子的O原子可以与胺基形成氢键。总之，通过材料表面的氨基/胺基与磷酸基产生相互作用，可较为选择性地捕获磷酸化肽。

基于MOAC材料的方法，一般是通过金属离子与磷酸基之间的路易斯酸碱作用捕获磷酸化肽。然而，材料表面其实并不均匀，导致各吸附位点对磷酸基的吸附能力存在强弱差异。于是，有研究者采取逆向思维方式以弱化材料的缺陷。先将MOAC材料用磷酸基修饰，然后磷酸化多肽可通过配体交换作用竞争性地与吸附能力弱的位点结合，从而使得目标肽在被富集后避免出现难以被洗脱等问题。

赋予材料多种功能基团以实现几种相互作用的联合应用，也是一种发展富集材料的思路。类似于MOAC材料，金属氧酸盐(poly oxometalates, POMs)也具有金属氧化物的表面特征，基于此，有研究者将其与半胱胺盐酸盐修饰的壳聚糖，以层层组装的方式包覆在磁性纳米粒子表面，从而制备了一种拥有金属氧化物表面特征、正电荷属性且能提供亲水作用的材料。

有一种被2-氨基对苯二甲酸修饰的金属有机骨架(metalorganic frameworks,MOFs)材料，在糖基化多肽与磷酸化多肽富集方面均有不错表现。另有一种二维MOF材料，同时利用了金属离子对磷酸基的吸附力、配体与多肽间的疏水相互作用。通过配体调节金属离子与多肽间的作用力强度，从而实现了对单磷酸化肽的选择性富集。

近十年来，研究者们已经发展了几十种不同于IMAC与MOAC原理的材料，它们的富集效果普遍优于经典方法，正逐渐形成磷酸化多肽富集技术的一个新分支，为磷酸化修饰的生物学意义研究提供了强力支撑。尽管这些新型材料已拥有不俗的表现，但发展简单快捷的富集技术以及推广新的技术，仍然是当前磷酸化蛋白质组学领域的重要目标，也是我们深化对磷酸化修饰认知的必经过程。

文章链接：https://doi.org/10.12677/AAC.2021.112005