提供荧火虫荧光素酶/海肾荧光素酶的活体成像发光底物

2024-05-10 10:24:45

目前常用于活体成像的荧光素酶主要来源于昆虫或深海生物。这两类酶的底物结构和反应机理差异较大，原则上可用于对体内的双细胞群体进行实时监测。

基于荧火虫荧光素酶(Firefly luciferase, FLuc)工程改造得到的AkaLuc，可以实现对小鼠的肺部内植入的单个细胞进行检测。另一方面，深海生物类别的代表系统是NanoLuc荧光素酶及相应的化学改造底物Furimazine (Fz)。在体外，表达NanoLuc的细胞所产生的光信号甚至可以简单地通过手机拍摄探测到，远亮于传统的海肾荧光素酶(Renilla luciferase)。

尽管在体外NanoLuc可以产生比FLuc高出100倍以上的光信号，但这两个系统在体内的表现却较为接近，这主要受限于底物Fz的物化和代谢性质。

一种新型的NanoLuc荧光素酶底物，为与NanoLuc相关的体内成像提供了一套实用的底物递送方案，并联合AkaLuc荧光素酶系统，实现了在小鼠体内对肿瘤和CAR-T细胞同时进行追踪监测的应用展示。

刚开始认为Fz同时拥有苄基和苯基的化学结构具有较高的疏水性，很可能限制了Fz在水溶液中的溶解度和在体内的生物利用度(bioavailability)。NanoLuc结合Fz的晶体结构表明Fz的苯基暴露在溶剂之中，是理想的修饰位点。因此，研究人员首先尝试将亲水性的羟基或氨基引入到Fz的苯环上。体外实验结果显示，苯环间位修饰的Fz衍生物的溶解度有显著的提升，且与Fz同样可被NanoLuc高效利用，在光学性质上无明显差异。

接下来，研究人员尝试在体内对Fz衍生物进行表征。种可用青色光激发的橙色荧光蛋白CyOFP1，进而发现NanoLuc与CyOFP1之间能高效地发生共振能量转移，使发射光大幅红移。在此基础上所发展出的Antares(CyOFP1-NanoLuc-CyOFP1融合蛋白)是一种新型荧光素酶，在体内具有更佳的组织穿透性和亮度。如今，研究人员构建了能在特定器官组织内表达Antares报告基因的转基因小鼠，为体内筛选NanoLuc底物提供了一个方便高效的平台。在转基因小鼠体内，苯环间位修饰羟基的Fz衍生物Hydroxyfurimazine (HFz)脱颖而出，可在安全剂量下产生近四倍于Fz的光信号峰值。另一种小鼠模型的建立则依靠尾静脉的流体动力学注射(hydrodynamic transfection)，将编码荧光素酶的基因快速转入小鼠的肝脏进行表达。在此模型中，Antares/HFz发光系统的表现优于同类型的其他荧光素酶，与Akaluc的信号表现也十分接近【图1】

图 1 Hydroxyfurimazine(HFz)与其他底物或荧光素酶体系的体内生物发光成像对比

在对底物进行体内筛选的过程中，研究人员发现含有聚乙二醇-300(PEG-300)的有机-水混合溶剂可以有效地溶解Fz衍生物，但该制剂配方在大剂量注射时会对实验动物产生一定的毒性，不利于长时间对同一动物的反复实验。为了解决该问题，研究人员引入了一种常用于药物递送的增溶剂poloxamer-407(P-407)。为了验证HFz/P-407制剂的安全性，研究人员对连续用药三天的小鼠进行了病理组织学研究分析，在主要器官中并无发现明显的损害。而在Antares转基因小鼠体内进行的成像实验，则证明了同剂量HFz所产生的光信号峰值并不受这两类溶剂的影响。有趣的是，P-407还对HFz有一定的缓释作用，使得HFz/P-407制剂非常适用于跨度一小时以上的体内动态成像实验。

氟元素在药物化学中有广泛的应用，对药物分子进行氟化修饰常常可以影响药物的药效强度、细胞膜透性和药物代谢动力学等性质。受此启发，作者们进一步对Fz的衍生物进行氟化修饰，并发现在苯环间位修饰氨基的Fz衍生物的基础上，通过引入两个氟原子修饰所得到的Fluorofurimazine (FFz)，在体内的发光表现相较HFz有更进一步的提升。在几种不同的小鼠模型中，Antares搭配安全剂量的FFz甚至可以发出比AkaLuc更强的光信号【图2】。

图 2 Fluorofurimazine(FFz)在体内生物发光成像的表现

FFz的优异表现促使研究人员来构建双荧光素酶的高灵敏度体内成像系统。作者们首先将Antares报告基因转入到MG63.3人骨肉瘤细胞系中，进而在NSG免疫缺陷小鼠的腿部构建了MG63.3的肿瘤模型。于此同时，研究人员又建立了稳定表达AkaLuc报告基因的CAR-T细胞（靶向识别MG63.3癌细胞表面的B7-H3蛋白），并于肿瘤细胞接种后的第十四天通过静脉注射到小鼠体内。在接下来的两周内，作者们通过注射FFz对肿瘤生长进行监测，或者通过注射AkaLuc的底物对外源T细胞进行追踪。结果表明，虽然对照组的非特异性T细胞也有一部分能定位到植入的肿瘤部位，但并不能有效抑制MG63.3肿瘤的生长。与之相比，CAR-T细胞在肿瘤部位的定位特异性更强，且对肿瘤有明显的治疗效果【图3】。

图 3 Antares/FFz 与AkaLuc/AkaLumine双荧光酶系统在同时监控肿瘤生长和外源CAR-T细胞的复制分布的体内成像应用

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