科研 | 海底沉积物细菌群落对墨西哥原油泄露的烃类降解和响应。
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深水地平线（DWH）的井喷导致向海底沉积高达4.9％的2亿加仑石油释放到墨西哥湾。泄漏后，井口附近的石油烃浓度很高，但在泄漏后几年又回到了最初水平。海底的微生物群落被认为是碳氢化合物降解的原因。我们通过用原油和分散剂修复DWH位点附近收集的海底沉积物来研究油的降解潜力和细菌群落的变化。在培养的前30天，多环芳烃迅速降解，而烷烃降解更慢。随着碳氢化合物的降解，Colwelliaceae，Alteromonadaceae，Methylococales，Alcanivorax，Bacteriovorax和Phaeobacter的相对丰度显着增加。然而，石油降解细菌的丰度随石油化学物质而变化。Colwelliaceae随着油降解的增加而减少，而Alcanivorax和Methylococcales则显着增加。我们从宏基因组中组装了7个基因组，包括Colwellia，Alteromonadaceae，Rhodobacteraceae，Woeseia属和NC10的基因组，所有这些基因组都具有碳氢化合物降解的基因库。此外，与油气降解相关的基因在油处理中高度富集，表明碳氢化合物是生物降解的，并且本地微生物群对深海表层沉积物中溢油的自然衰减具有显着的潜力。
论文ID
原名：Hydrocarbon degradation and response of seafloor sediment bacterial community in the northern Gulf of Mexico to light Louisiana sweet crude oil
译名：海底沉积物细菌群落对墨西哥原油泄露的烃类降解和响应
期刊：The ISME Journal
IF：9.520
发表时间：2018年6月
通信作者：Deana L. Erdner
通信作者单位：美国德克萨斯大学奥斯汀分校海洋科学研究所
实验内容
1 烃类降解
不同处理修复如表1。在孵化的前30天期间，PAHs在所有处理中的降解速度比烷烃快（图1a-c）。在SOC处理中，在第20天仅剩余30％和21％的PAH和烷基化PAH，而60％的烷烃未降解。此外，与两种处理（SWO和SWOC）相比，SOC中所有时间点的烷烃和PAH的降解百分比更高。分散剂Corexit在120天时增强了烷烃的降解，但不影响PAH降解。虽然烷烃降解持续至180天，但60天后PAH降解可忽略不计。SOC中烷烃的降解速率常数（k）高于SWOC，高于SWO。尽管PAHs和烷基化PAHs的速率常数不同，但对于大多数PAHs，SOC通常表现出最高的降解速率，并且SWO的速率略高于SWOC。还要注意，在所有处理中，具有较低分子量的PAH和烷烃的速率常数通常高于具有较高分子量的那些。
图1：（a）总烷烃，（b）总PAHs和（c）用原油改良的深海沉积物中总烷基化PAHs的生物降解。SOC：沉积物+油+ Corexit，SWOC：沉积物+水+油+ Corexit，SWO：沉积物+水+油
2 细菌群落结构和动态
在存在或不存在油的情况下孵育显示细菌群落结构的变化，但是添加油的效果更大（图2）。对照群落（S和SW）彼此不同（P = 0.1212），但与油处理有显着差异（P = 0.0001）。单独使用油或使用油和分散剂的处理之间没有显着差异（P = 0.8865）。此外，单独使用油和分散剂的沉积物与沉积物水浆没有差异（P = 0.8272）。
图2：在有或没有原油的情况下孵化的深海沉积物中细菌群落结构的非度量多维尺度（NMDS）
最初的细菌群主要由Gammaproteobacteria，Deltaproteobacteria，Alphaproteobacteria，Planctomycetes，Acidobacteria和Actinobacteria组成（图3）。在对照和油修复处理中观察到细菌群落结构的变化，最显着的是Gammaproteobacteria。平均而言，对照组中的Gammaproteobacteria丰度增加了1.2倍，而它们在油处理中的丰度增加了约2倍。在目水平上，Gammaproteobacteria的增加主要是由于Alteromonadales，Oceanospirillales和Methylococcales。除了Gammaproteobacteria, Rhodobacterales和Bdellovibrionales在油处理中增加。
图3：在有或没有原油的存在下的深海沉积物中的细菌群落动态
Alteromonadales序列包括与HB2-32-21紧密相关的Altermonadaceae，其在对照中增加2-3倍，在处理中增加20-34倍，并且属于Colwelliaceae的两个属（图4）。未分类的Colwelliaceae在最初的15天内对油的修复作出了极大的反应，增加了100倍，然后稳定下降。Colwelliaceae的逐渐减少与未分类的甲基球菌（15天时为50倍，180天时为180倍），Alcanivorax（30天时为10倍，180天时为700至900倍），和Oleiphilaceae丰度的增加相关。在孵育30-60天时S对照中其他Colwelliaceae的增加占Colwelliaceae总量的50％以上，但是这种OTU似乎不代谢石油，因为它们显示出油处理的可忽略的增加。在处理中，Bacteriovorax在30和60天分别大幅增加40倍至300倍，而在对照中仅约10-20倍。尽管存在相对较低的丰度，但随着添加石油，Phaeobacter和Octadecabacter增加了10倍
图4 ：在有或没有原油的情况下深海沉积物Alteromonadales, Methylococcales, Oceanospirillales, Rhodanobacterales和Bdellovibrionales下的属的丰度增加。
3. 碳氢化合物降解基因的丰度
宏基因组学分析表明，相对于对照（S-30），参与烃降解的各种基因在油处理（SOC-30）中富集（图5）。与芳环的初始氧化相关的基因通常比对照中的烷烃单加氧酶更丰富。然而，虽然这些芳香基因平均增加了2.5倍，但烷烃单加氧酶在处理中增加了4.5倍。在对照中未检测到，甲苯，甲烷和丁烷双加氧酶在油存在下出现。此外，涉及烃降解副产物（包括醇和环己醇脱氢酶）代谢的基因以及与脂肪酸代谢相关的基因是最丰富的。参与完全氧化烷烃的一组基因在深海沉积物中丰富并且在添加油后增加。同样，我们发现了几乎完整的环己烷降解基因。儿茶酚和苯甲酸双加氧酶是通常负责芳环完全氧化的两个基因，以较低的丰度检测到。
与无氧代谢相关的基因也被富集。与对照相比，在存在油的情况下，反硝化基因（例如硝酸盐还原酶，亚硝酸还原酶，一氧化氮和一氧化二氮还原酶）的丰度增加了4倍。值得注意的是，厌氧烷烃和芳香族降解的潜力分别通过烷基琥珀酸合酶（assA）和苄基琥珀酸合酶（bssA）的轻微增加来指示。此外，苯甲酰辅酶A还原酶是厌氧芳香代谢的另一种关键酶，当加入油时会增加。
图5：涉及碳氢化合物降解宏基因组数据中的基因丰度
4. 基因组的重建
对石油处理的宏基因组数据的装配，重建7个基因组箱（指定为Bin 6,8,17,18,19,20和21）（表2）。完整性为17％至50％，污染率低（<10％）。对15个核糖体蛋白的系统发育分析将Bin 20鉴定为属于Colwellia属的Gammaproteobacterium并且与Dombrowski等人的Bin 37密切相关。（图6）。Bin 21也与Colwellia属密切相关，但与Bin 20不同。两个基因组都具有萘双加氧酶，但缺乏天然气和苯，甲苯，乙苯和二甲苯（BTEX）降解的基因。Bin 8与Woeseia oceani XK5类似，这是从沿海沉积物中鉴定出的Chromatiales的新属。这是第一份报告深海沉积物中该属存在的研究。Bin 8含有一系列基因，用于完全降解萘和BTEX化合物的初始氧化。Bin 17属于Candidate Phylum NC10，其成员与厌氧氧化甲烷和反硝化有关。Bin 6（Alteromonadales），Bin 18（身份不明）和Bin 19的基因组（Rhodobacteraceae）具有许多的芳香降解基因，被认为与PAH降解有关。烷烃单加氧酶是烷烃降解中的关键酶，仅存在于Bins 6和21中。值得注意的是，Bin 21具有完整的烷基总氧化途径基因。在7个重建基因组中的5个中发现了反硝化基因narG和nirK。
图6：基因组Bin8，Bin 17和Bin 20的系统发育表征
讨 论
迄今为止，记录深海沉积物的细菌群落和潜在的碳氢化合物降解的研究相对较少。在每个研究中，从井口周围的不同距离收集沉积物，分析微生物群落或宏基因组，并检查可能的代谢或烃降解潜力。石油降解细菌和丰富的功能基因，以及分子水平上的石油化学变化，没有记录在这些中，或者据我们所知，很少有这方面的研究。
PAHs及其烷基化同系物在沉积物的前30天内比烷烃降解得更快。这些数据与Yergeau等人的结果一致。他们报告了DWH井口周围0厘米深的沉积物中高浓度的烷烃，而PAHs和甲基化PAHs都低。使用13C标记的十二烷，甲苯和菲，Mason发现十二烷的降解速度比菲和甲苯都快，这与我们的发现相反。使用单一基质可改变细菌对烃的优先降解，因此原油可更能代表溢油情况。我们的数据遵循短链（C11-C14）烷烃代谢速度快于中链（C15-C22）的典型模式，长链> C30的降解最少。在30天后，PAH降解减慢，因为剩余的4-5环PAHs更难以降解。然而，许多烷基化PAHs比PAHs更快地消失，特别是单烷基化萘，其代表物是油中大部分烷基化PAHs。单独沉积物中所有烃基的生物降解也更快，表明海洋表面可能通过降低生物利用度而降低烃降解，因为在水上观察到浮油光泽。单独使用海水，Kleindienst表明添加Corexit会对正构烷烃和多环芳烃的降解产生负面影响。然而，我们的结果显示，在泥浆沉积物中，Corexit增强了正构烷烃的降解，但没有增强PAHs和烷基化PAHs的降解。
与对照相比，我们观察到微生物群落组成随油变化更大。无论如何，对照和修复之间细菌组成的差异应该归因于油作为关键驱动因素。例如，在油或油和分散剂存在下，Alteromonadales, Methylococcales, Oceanospirillales, Rhodobacterales和Bdellovibrionales的增加。我们孵化中的细菌群落与DWH溢出后收集的沉积物中的群落具有一些共同特征。DWH位点附近受污染的沉积物含有丰富的Gammaproteobacteria，特别是未培养的Gammaproteobacterium, Colwellia和Rhodobacteraceae。
在这里，我们发现Colwellia最初占主导地位，但随着石油降解而显着下降，其他分类群包括Alcanivorax和Methylococcales。Yergeau等人在DWH后19个月收集了表面沉积物。包括低丰度的Oceanospirillales, Alcanivorax, Colwellia和Methylococcaceae，与我们最初的沉积物群落相当。相比之下，Kimes等人发现了更高水平的厌氧Deltaproteobacteria，这在本研究或Mason等人的研究中并不丰富。我们之前关于深海沉积物样品表面细菌群落的报告主要发现了甲基球菌，弧菌，假单胞菌，甲基杆菌，黄杆菌和酸杆菌，而弧菌和假单胞菌在我们的核心中并不占优势。初始细菌组成的这种变化可能是由于取样部位或时间的差异，以及油污染和风化的程度。
几种细菌分类群的动态与油成分的降解有关。Colwelliaceae和Altermonadaceae在最初的群落中几乎检测不到，但在15天后仍占群落的15-20％和4-8％。这表明这些细菌在降解的早期阶段起着关键作用，因为在此期间，25-50％的正构烷烃C11-C15和60-80％的萘被降解。Alteromonas是已知的萘降解菌株。DWH中含有乙烷，丙烷和苯，表明Colwellia可以降解轻质烷烃和芳烃。我们的结果支持这些发现，因为随着低分子量碳氢化合物的消失，Colwellia丰度急剧下降（图4）。另一种Colwelliaceae在对照中含量丰富，表明Colwelliaceae种系的多样性-具有烃降解以外的功能。15天后，Alteromonas仍然丰富，而Colwelliaceae数量下降，同时Alcanivorax和Oleiphilaceae增加，可以降解长链烷烃，并且在风化油中含量丰富。这是因为到那时，修复已经耗尽了短烷烃，剩下中长链烷烃。
宏基因组提供了深海沉积物群落中石油降解能力的进一步证据。与脂肪族和芳香烃代谢相关的功能基因类别存在于沉积物中，并且随着石油的添加而增加（图5）。参与芳族化合物初始氧化的基因比烷烃加氧酶更丰富，这支持观察到PAHs在孵化的前30天内容易降解。最丰富的基因是醇脱氢酶，环己醇脱氢酶和参与脂肪酸氧化的基因。我们还发现了一整套用于环己烷降解的基因。我们证明这些基因随着石油的添加而增加。我们观察到厌氧烃降解（assA，bssA）的基因略有增加，这一过程发生得非常缓慢。这是因为虽然我们的初始条件是有氧的，但沉积物中的区域可能变得缺氧而缺氧。60毫升密封罐装有约6立方厘米的沉淀物，顶部空间含有足够的氧气，可完全氧化可量化的碳氢化合物。在整个培养期间表面可能是有氧的，但是大量的碳氢化合物降解可能导致下面的缺氧条件，反映了海底的原位条件。深海沉积物也可以改变其他代谢途径，例如氮循环，这可以通过观察到的反硝化基因的大量增加来证明。因此，大量不稳定烃的降解可以产生在实验条件下增强反硝化作用的微环境。
Colwelliaceae（Bin 20和Bin 21）的部分基因组包含与Colwellia psychrerythraea 34H相似的反硝化基因，这是一种兼性厌氧菌，表明在培养期间发生好氧和厌氧过程。虽然PAH双加氧酶和萘双加氧酶在四个基因组中很丰富（Bin 6,8,18,19），但烷烃单加氧酶仅在两个基因组中检测到（Bins 6和21）。尽管如此，在四个基因组中发现了一系列烷烃代谢物降解基因，表明许多烷烃很可能已被完全氧化。Colwelliaceae Bin 21具有广谱的底物利用基因，可以解释其降解多种碳氢化合物的能力。值得注意的是，与Woeseia密切相关的Bin 8具有几乎完整的基因，用于降解BTEX化合物，脂肪族和芳香族烃。Bin 17与NC10密切相关，NC10将厌氧甲烷氧化与反硝化作用联系起来，这是孵化过程中存在缺氧条件的另一个迹象。Bin 17基因组中亚硝酸盐和硝酸盐还原酶和萘双加氧酶的存在表明碳氢化合物降解与反硝化作用相结合的可能性。NC10相关细菌已在限氧淡水栖息地，湖泊沉积物，稻田土壤，污水污泥和海水水柱氧气最小区域中被发现，但这是深海沉积物中NC10细菌的首次报道，特别是相关碳氢化合物降解。我们的质量平衡计算表明，顶空中的氧气足以使碳氢化合物完全氧化成CO2和H2O。然而，只有20-60％的油被生物降解转化为二氧化碳，其余的可以转化为代谢物或转化为生物质。沉积物中其他有机化合物的降解可能也导致在实验的后期孵化瓶中氧的耗尽，导致有氧表面层和缺氧/缺氧底层。这里的细菌群落与缺氧环境一致。
总 结
在这项研究中，我们证明了深海沉积物细菌对原油的响应，包括群落组成和碳氢化合物代谢。我们发现当加入石油时PAHs很容易降解，但烷烃降解发生得更慢。我们基于烷烃，多环芳烃和烷基化多环芳烃的一级模型计算了降解速率常数，这些模型可用于模拟深海表层沉积物中的石油的降解。使用16S rRNA基因测序和宏基因组学，我们发现Colwelliacea，Altermonadaceae，Methylococcales，Rhodobacteraceae和Alcanivorax随着油的添加而增加。随着石油的持续降解，Colwelliacea后来逐渐减少，Alcanivorax和Methylococcales相应增加。我们根据油成分的变化将这些细菌在碳氢化合物降解中的推定作用联系起来。最后，组装的宏基因组将降解潜力分配给沉积物中微生物群落内的单个细菌。我们的研究结果对于了解细菌分类群在深海沉积物中的降解石油作用至关重要，并且可以为该地区未来的石油泄漏提供补救措施。
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