编译：胜寒，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
宿主免疫在肠道菌群介导的对艰难梭菌感染(CDI)的定殖抗性中的作用尚不完全清楚。在这里，作者证明了由肠道菌群定殖诱导的白细胞介素(IL)-22对预防人类微生物群落相关(HMA)小鼠的CDI至关重要。HMA小鼠IL-22信号调节宿主糖基化，使消耗琥珀酸的考拉杆菌属物种在肠道菌群中生长。考拉杆菌属使得琥珀酸盐减少，而琥珀酸盐是艰难梭菌生长的重要代谢物，因此阻碍了艰难梭菌的生长。IL-22介导的宿主N-糖基化在溃疡性结肠炎(UC)患者中可能受损，使UC-HMC小鼠更容易受到CDI的影响。健康的人源微生物或考拉杆菌属移植降低了UC-HMA小鼠的腔内琥珀酸水平并恢复了定植抗性。因此，IL-22介导的宿主糖基化促进了与艰难梭菌竞争营养生态位的共生细菌的生长。
原名：Interleukin-22-mediatedhost glycosylation prevents Clostridioides difficile infection by modulating the metabolic activity of the gut microbiota
译名：白介素22介导的宿主糖基化通过调节肠道菌群的代谢活动来预防艰难梭菌感染
期刊：Nature Medicine
IF：30.641
发表时间：2020.2
通讯作者：Nobuhiko Kamada
作者单位：美国密西根大学医学院消化内科
将健康人的肠道菌群移植到无菌小鼠中，发现可以抑制艰难梭菌感染，而菌群定殖产生的IL-22可以增强宿主糖基化，促进考拉杆菌属物种的生长，从而减少肠腔中可利用的琥珀酸盐，进而抑制艰难梭菌的生长。在溃疡性结肠炎患者中，MGAT4A等糖基转移酶的表达明显降低，表明IL-22介导的宿主N-糖基化可能受损。
1 健康人的菌群保护无菌小鼠不受CDI感染
作者研究了来自人类的微生物群对CDI的保护作用。将两个健康对照(HCs)中分离的肠道菌群定植在无菌小鼠（GF）。艰难梭菌株VPI 10463感染HC-HMA 小鼠。作为对照，没有微生物群定殖的GF小鼠也感染了艰难梭菌。艰难梭菌能够在感染后第1天定植对照组的GF小鼠，第二天所有小鼠都死于CDI。为了证实肠道菌群的重要性，作者用广谱抗生素鸡尾酒疗法治疗HC-HMA小鼠。与预期一样，经过抗生素处理的HC-HMA小鼠在CDI后第1天出现明显的梭状芽胞杆菌定植，大多数小鼠死于CDI。与粪便病原体负担数据一致，抗生素处理过的HC-HMA小鼠在结肠中出现炎症病理，而对照组的HC-HMA小鼠没有发现明显的炎症。这些数据表明，人类来源的微生物群在小鼠体内形成了对艰难梭菌的定殖抗性。
2 菌群诱导的IL-22可预防CDI
缺乏T和B细胞的Rag1−/−小鼠被用来研究宿主免疫在人类微生物在艰难梭菌的定殖抗性中发挥的作用。利用HC菌群对GF-Rag1−/−小鼠进行定植，产生HC- HMA-Rag1−/−小鼠。HC-HMA-Rag1−/−小鼠和对照组Rag1−/−小鼠感染艰难梭菌。所有的GF-Rag1−/−小鼠在感染后2天内死于CDI。相比之下，艰难梭菌无法在HC-HMA-Rag1−/−小鼠中生长，正如在HC-HMA野生型(WT)小鼠中所见(图1a)。这一结果表明，宿主T和B细胞的免疫在人类菌群抵抗艰难梭菌的过程中是不需要的。相反，宿主的固有抗菌反应是由微生物群引起的，在预防CDI中发挥作用。在这方面，作者发现，人类菌群对GF-Rag1−/−小鼠的定殖诱导了粘膜IL-22的表达(图1b)。这一证据提示IL-22参与了一种潜在的微生物介导的对CDI的保护机制。为了验证这一假设，作者检测了IL-22信号阻断对HC-HMA-Rag1−/−小鼠CDI易感性的影响(图1c)。IL-22信号在体内被抗IL-22抗体有效抑制。抗体治疗也抑制了Reg3b和Reg3g的表达，这两种抗菌蛋白对IL-22有很强的诱导作用。在这种情况下，HC-HMA-Rag1−/−小鼠的定植抗性被消除，艰难梭菌能够定植IL-22中和的HC-HMA-Rag1−/−小鼠(图1c)。根据其定殖潜力，当IL-22信号被阻断时，艰难梭菌在HC-HMA-Rag1 /小鼠中诱导了大量炎症(图1d)。因此，在HMA小鼠中，微生物诱导IL-22对于预防艰难梭菌大量繁殖至关重要。
图一 健康人体的微生物驱动的IL-22可以防止艰难梭菌在肠道内繁殖
3 IL-22对菌群及其代谢功能的影响
接下来，作者试图研究IL-22阻止CDI的机制，并研究IL-22对肠道微生物菌群组成的影响。作者分析了抗IL-22抗体处理的HC-HMA-Rag1−/−小鼠的肠道菌群。IL-22中和没有改变微生物菌群的多样性和丰富度，但改变了肠道菌群的组成。特别是在IL-22中和后，它导致酸球菌科的丰度下降。线性鉴别分析效应量(LEfSe)进一步鉴定了IL-22中和后过度和不足表达的细菌属(图2a)。其中，作者重点研究了考拉杆菌属，由于IL-22的阻断，其数量显著减少(图2a)。考拉杆菌属是琥珀酸的主要消费者。因此，考拉杆菌属丰度的降低可能导致肠道内琥珀酸代谢异常。与这一假设一致，在IL-22中和的HC-HMA-Rag1−/−小鼠中，琥珀酸的管腔水平显著升高(图2b)。值得注意的是，众所周知，琥珀酸钠有助于艰难梭菌在肠道内的生长。因此，IL-22信号阻断引起的肠道失调导致的琥珀酸代谢失衡可能会影响宿主对CDI的敏感性。为了继续探索，作者利用了一株缺乏琥珀酸利用基因操纵子CD2344的艰难梭菌突变株。艰难梭菌的CD2344突变体(Cd-CD2344)与它的同基因WT菌株JIR8094不同，不能在琥珀酸盐上生长。IL -22中和的IL -22小鼠对CDI敏感，分别感染WT JIR8094和Cd-CD2344(图2c)。如图1所示，艰难梭菌能够在IL -22中和的HC-HMA-Rag1−/−小鼠中定植(图2c)。相比之下，Cd-CD2344早期定植明显受损(图2c)。为了研究琥珀酸在CDI易感性增加中的关键作用，作者给HC-HMA小鼠注射了琥珀酸。作者观察到，在HC-HMA小鼠中，琥珀酸促进了梭状芽胞杆菌的生长(图2d)，这表明琥珀酸是一种关键的代谢物，其丰度控制了梭状芽胞杆菌在肠道中的定植。有趣的是，Cd-CD2344能够在GF小鼠中定植，这表明艰难梭菌可以利用其他营养来源来生长，而不需要共生菌群。接下来，作者检测了吞噬琥珀酸的考拉杆菌属的定植是否可以预防CDI。SPF级C57BL/6小鼠用头孢哌酮预处理，以突破肠道定殖抗性。如前所述，头孢哌酮处理的小鼠死于CDI(图2e)。两株考拉杆菌P. faecium JCM 30894和P. succinatutens JCM 16074的定植显著提高了艰难梭菌感染小鼠的死亡率(图2e)。这些结果表明，由微生物群诱导的IL-22可以调节特定共生菌的丰度，如考拉杆菌属，并导致代谢物的积累，包括琥珀酸，这可能会促进艰难梭菌的生长。
图二 IL -22介导的琥珀酸途径驱动艰难梭菌在健康菌群中定植
4 宿主黏液糖基化调节肠道菌群
考虑到IL-22信号被阻断后，肠道中消耗琥珀酸的细菌考拉杆菌丰度明显下降，可以认为IL-22信号促进了考拉杆菌在肠道中的生长。为了验证这一假设，作者用两株考拉杆菌 P. faecium JCM30894和P. succinatutensJCM 16074定植GF小鼠，然后用IL-22-Fc融合蛋白进行处理。经IL-22-Fc处理后，粪便中宿主基因组DNA数量保持不变(图3a)。IL-22- fc显著增强了两株菌的肠道定殖(基因拷贝归一化至宿主基因组DNA)，提示IL-22直接调控了考拉杆菌的生长(图3a)。考拉杆菌属的生长主要受琥珀酸的限制，而碳水化合物和短链脂肪酸(SCFAs)似乎不是主要的重要因素。然而，在GF小鼠中不能得到琥珀酸盐，因为产生琥珀酸盐的共生细菌消失了。这表明，考拉杆菌属可以利用其他营养来源来促进IL-22-Fc处理的无菌小鼠的生长。结果表明，P. faecium JCM 30894 和P. succinatutens JCM 16074均含有糖苷水解酶(GH)家族的酶，即GH73。考虑到GH73是宿主糖相关酶家族(N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc))的成员之一，考拉杆菌可能已经适应了在肠道中消耗宿主衍生的糖链。为了验证这一点，作者从使用抗IL-22抗体或同型对照抗体的SPF小鼠中分离出粘液。将分离的黏液加入到离体的考拉杆菌培养基中。补充从对照组小鼠中分离出的黏液可以促进粪杆菌和琥珀酸杆菌的生长(图3b)。与此相反，当从IL -22中和小鼠中分离出粘液后，P. faecium和P. succinatutens的生长明显减弱(图3b)。与此结果一致，P. faecium和P. succinatutens在黏液中培养时表达GH73(图3c)。此外，补充GlcNAc可以促进考拉杆菌的生长(图3d)。这些结果提示IL -22诱导的宿主黏液糖基化可能促进了考拉杆菌的生长。作者还评估了宿主糖基转移酶在HC-HMA小鼠中的表达，以及这些酶是否通过IL-22信号传导被调节。如图3e所示，在GF小鼠中，Mgat4a等与N-糖基化相关的宿主糖基转移酶被人菌群定植后诱导产生。当IL-22信号传导被阻断时，这些酶的表达水平显著降低，因此，由微生物诱导的IL-22对其中一些酶的诱导起作用(图3e)。接下来，作者分析了有或没有IL-22信号阻断的HMA-Rag1−/−小鼠的宿主糖基化状态。作者发现，在IL -22中和的小鼠中，宿主蛋白的n -糖基化受到了损害，包括不溶性部分(主要是黏液蛋白，如Muc2)和可溶性部分(肠细胞，如上皮细胞)。值得注意的是，IL-22中和小鼠的高甘露聚糖可溶性组分减少，混合聚糖的不溶性组分减少。相反，在IL -22中和的小鼠中，o -糖基化没有发生变化。这些发现表明，IL -22介导的宿主n -糖基化可能促进某些共生菌群的生长，如考拉杆菌。
图三 IL-22调控的宿主糖基化作用影响考拉杆菌属的生长
5 UC患者N-糖基化相关基因表达受损
接下来，作者研究了IL-22介导的宿主糖基化与宿主对潜在疾病导致的CDI敏感性增加之间的联系。为此，作者将重点放在UC患者身上，与正常人相比，他们患CDI的风险更高。利用一个公开的数据库(GSE75214)，作者发现，与HCs相比，UC患者的MGAT4A和MGAT4B等宿主糖基转移酶的表达明显受损(图4a)。IL-22结合蛋白（ IL-22BP)是一种可溶性的IL-22受体，可阻断IL-22的信号传导，其表达在UC患者中显著上调，而IL-22的表达未受影响(图4a)。值得注意的是，IL22RA2的表达与这些糖基转移酶的表达呈负相关，表明IL-22BP过表达导致IL-22信号通路受损，从而导致UC中宿主糖基化水平下降(图4b)。与这些结果一致的是，感染UC (UC-HMA小鼠)菌群的HMA小鼠无法抵抗艰难梭菌的定植(图4c,d)。与体内数据一致，接种艰难梭菌后，使用从HC-HMA小鼠体内分离的管腔内容物未能在体外增殖(图5a)。另一方面，艰难梭菌是从UC-HMA小鼠体内分离到的囊腔内容物中生长出来的(图5a)。正如所料，艰难梭菌的生长依赖于琥珀酸，因为Cd-CD2344突变体在体内和体外均表现出UC 肠腔内容物的生长受损(图5b,c)。
图四 UC患者N-糖基转移酶基因表达及CDI风险
图五 UC患者的艰难梭菌利用琥珀酸来促进自身的生长
6 菌群代谢的恢复降低了CDI的风险
最后，我们测试了粪便微生物菌群移植(FMT)能否恢复UC-HMA小鼠正常的微生物代谢活性和定殖抗性。将HC-HMA 小鼠来源的菌群接种于UC-HMA小鼠体内，然后感染艰难梭菌(图6a)。因此，FMT几乎完全阻止了艰难梭菌在肠道内的生长(图6b)。我们发现，一次FMT与多次FMT在预防CDI方面效果相同(图6b)。由于FMT，肠道失调在UC-HMA小鼠明显改善(图6 c ,e),考拉杆菌属大量恢复(图6 f),琥珀酸在FMT后显著降低(图6g)。为了验证考拉杆菌属在预防CDI中的重要性，我们将UC-HMA小鼠接种了琥珀酸消费者，P. faecium和P. succinatutens(图6h)。不出所料，P. faecium和P. succinatutens的定植显著降低了琥珀酸盐的浓度(图6i)。表明考拉杆菌属明显抑制了艰难梭菌的定植，尤其是在感染的早期(Fig. 6j)。
图六 代谢物的恢复降低了艰难梭菌感染的风险
利用HMA小鼠模型，我们证明了肠道菌群定殖诱导的IL-22形成了肠道常驻菌群的组成。IL-22信号转导促进了宿主糖化转移酶的表达，如Mgat4a和Mgat4b，它们编码的酶可以催化GlcNAc向核心甘露糖残基的转移。GlcNAc的总体丰度似乎没有变化，尽管可溶性和非可溶性黏液部分的N-糖基化受到IL-22信号损伤的影响。这表明，GlcNAc向N链聚糖的转移可能只在宿主来源蛋白的亚群中受到损害。宿主糖基化在维持特定的肠道共生菌群中起重要作用，如考拉杆菌属，它们利用宿主来源的GlcNAc进行生长。IL-22信号受损导致的菌群代谢功能受损，从而增加了艰难梭菌等潜在病原体的机会性生长。据之前研究表明，与健康对照组相比，CDI患者中考拉杆菌属的丰度明显降低。FMT后CDI患者的考拉杆菌属丰度恢复，临床症状得到改善。说明考拉杆菌属在CDI中对宿主存在保护作用。然而，对考拉杆菌属在肠道菌群中调节的机制仍知之甚少。在本研究中，我们发现考拉杆菌属含有与宿主糖链降解相关的糖苷水解酶，这表明考拉杆菌属除了消耗琥珀酸外，还具有搜寻宿主糖链的能力。因此，IL-22介导的宿主N-糖基化可能促进该菌属在肠道内的生长。我们推测，考拉杆菌属的丰度增加导致了肠道内琥珀酸盐的更有效消耗，从而限制了艰难梭菌的机会性生长，而艰难梭菌的增殖得到了琥珀酸盐的辅助。有趣的是，使用考拉杆菌属能够充分保护经过抗生素治疗的小鼠不受CDI的侵害。此外，即使在艰难梭菌定植后接种，考拉杆菌属也能提高受感染动物的死亡率。这些数据表明，考拉杆菌属可能对已经感染艰难梭菌的患者有用。然而，值得注意的是，单次给药，用考拉杆菌属预处理不足以防止艰难梭菌定植和随后的致命结肠炎，这表明考拉杆菌属必须在肠道中保留一个最佳数量，以最大限度地发挥它们对CDI的保护作用。与CDI相比，IBD患者对FMT的临床反应是可变的。IBD患者对FMT无反应，至少部分可能是由于宿主糖基化受损导致的营养生态位不足。在这种情况下，FMT和重组IL-22(或与IL-22诱导菌共接种)的组合可以最大化移植有益菌的定殖潜力，如在肠道内的考拉杆菌属。总而言之，该研究的数据阐明了IL-22在肠道菌群反馈调节中的作用。IL-22诱导的宿主糖基化调控肠道菌群特定的保护成分的生长，例如考拉杆菌属和IL-22使菌群的组成正常化并影响其代谢活动，这可能对预防肠道内艰难梭菌的机会性定植和扩增至关重要。
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