综述 | 益生菌微胶囊化研究进展
编译：小白同学，编辑：小菌菌、江舜尧。
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由于在食物储存和胃肠道消化过程中益生菌活性降低，其潜在的益生作用大打折扣。通过微胶囊化可提高益生菌的生存能力，包埋或包覆后口服的方式可以使更多益生菌被输送到结肠。
本文介绍了益生菌微胶囊化的新策略，重点关注益生菌耐受性的关键机制，也探讨了近期用于评估益生菌输送效率的体外和体内模型。包埋技术有助于保持益生菌在贮存期间和在人肠道内的活性，提高其在结肠的定植能力。该技术的工作原理是保护益生菌免受恶劣环境条件的影响，同时增加其粘附性。一般来说，食品级材料（如生物聚合物或脂质）会将益生菌嵌入内部或包裹起来。有时，也会有其他成分（如营养物质或保护剂）协同参与包埋以提高益生菌的生存能力。本文强调，有必要建立合适的体外和体内模型以评估益生菌传送的有效性。
论文ID
原名：Progress in microencapsulation of probiotics: A review
译名：益生菌微胶囊化研究进展
期刊：Comprehensive reviews in food science and food safety
IF：9.912
发表时间：2020.02
通讯作者：李兰娟
作者单位：浙江大学
主要内容
引言
肠道菌群对维持人类健康起着关键作用，肠道内不同微生物的数量、种类和相互作用与各种急/慢性疾病有一定关联。研究人员试图找出那些与特定健康问题相关的肠道微生物的特征，并利用这些知识来调控人体中微生物群落组成结构，从而解决特定健康问题。粪菌移植能有效治疗梭状芽胞杆菌感染、肠炎和其他胃肠疾病。但这并非常规疗法，研究人员希望用口服益生元、益生菌等微生物制剂的方法来调控肠道菌群以替代粪菌移植。益生元是指能促进肠道中益生菌生长的食物成分(如低聚糖)，而益生菌是指经过消化道后在肠道定居并对人体有益的活菌。研究表明，口服益生菌制剂有利于构建健康的肠道菌群，因而涌现了大量富含益生菌的食品和保健品。通过评估一些商业益生菌在消化道运输过程中的活性发现，被测产品在胃液中孵育5分钟后菌落大量减少。因此，人们担心许多商用益生菌经食品加工、存储及消化道运输过程后无法存活。即便顺利到达结肠，它们也未必能定植并成为肠道菌群中的一部分，益生菌也很可能会通过粪便被排出体外。目前商业产品中使用的益生菌大多属于乳酸菌属或双歧杆菌属，它们对食物和人体肠道中的胃酸等不利环境条件尤其敏感，这限制了其益生作用的发挥。因此，需要更有效的方法来提高益生菌在食品及人体肠道中的稳定性。微胶囊化可有效防止益生菌被降解，不仅能维持益生菌在贮藏过程中的稳定性，还能保护其通过消化道抵达结肠，提高活菌在肠道表面粘膜的定植能力。人们提出了各种益生菌胶囊化口服的方法，但由于受胃酸、酶等作用，它们未能充分保障益生菌在消化道内的活性。本文旨在总结益生菌有效口服方法的最新研究进展，特别是提高益生菌在食品和消化道中的活性方面。此外，这里也将针对体外和体内评估模型进行探讨。
1 食物和人消化道中的不利环境条件
只有深入理解食物摄入前后经历的各种不利环境条件，才能有针对性地设计出有效的传送方法。在食品制造、储存、运输和胃肠道消化过程中，影响益生菌活性的物理化学因素包括光照、氧气、胃酸、消化酶和胆汁酸等，主要是氧含量、相对湿度、温度、渗透压、和pH。当氧含量、相对湿度、渗透压和温度较高时，大多益生菌生长受抑制。人体肠道中多为厌氧微生物，缺乏完整的电子传递链，氧的不完全还原导致产生过氧化氢，这种氧代谢产物的毒性在细胞中积累最终导致细胞死亡（氧中毒）。湿度对益生菌制品也是个大问题，因为摄入益生菌后充足的水分使细菌活化并开始降解。人类肠道中的微生物适于在人体温度下生存，而巴氏灭菌、消毒、脱水或烹饪等食品加工过程可能造成益生菌失活。除了一些芽孢杆菌外，多数商业益生菌菌株不耐热，须使它们免于受热。
益生菌被摄入后，在消化道（尤其是胃和小肠）中会经历多种恶劣的环境条件。在口腔中，它们与含有粘蛋白、矿物离子和淀粉酶的唾液混合在一起，随后被吞咽进入食道到达胃。益生菌适于在人肠道pH（6-7）条件下存活，而胃液酸性较强（pH约为1-3），使细胞质pH降低，不利于益生菌生存；高浓度的氢离子和糖酵解酶活性的降低对负责抵御酸性环境的质子泵有一定影响。胃中其他潜在不利条件包括较高的离子强度、酶活性(胃蛋白酶)和机械搅拌，这些都会影响益生菌的生存能力。在小肠中，胆汁和消化酶(脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶等)对益生菌活性有影响。胆汁能促进摄入的脂质被消化吸收，同时也有破坏细胞膜和DNA等抗菌特性。有些益生菌能够合成胆汁酸盐水解酶，将胆汁分解为未结合的胆汁酸和甘氨酸，然而益生菌在体内与胆汁酸的相互作用机制仍有待进一步研究。小肠中存在大量胆汁（特别是摄入脂肪类食物后），因此可能使益生菌活性降低。到达结肠后，益生菌与土著细菌竞争，粘附于肠道黏膜并在其上定植。例如鼠李糖乳杆菌可分泌一种粘附蛋白，促使其结合于宿主上皮细胞。
2 发展益生菌运送方法所面临的挑战
这里总结一些发展益生菌运送方法所面临的重要挑战。第一，制备过程中要避免对益生菌活性造成不利影响，如有机溶剂、强酸或强碱、表面活性剂、过度加热、机械搅拌和曝气等。对于许多食品，须通过热处理灭活病原体，但这些过程也可能使益生菌失活，很少有益生菌具有耐高温的特性。因此，迫切需要分离鉴定或改造耐热益生菌菌株，并开发新的封装技术来提高其耐热性。
第二，许多封装小分子（如维生素、营养物质、色素或调料等）的胶体运载系统由于粒度太小难以容纳益生菌（图1）。微生物细胞的大小通常为1-10𝜇m，而许多胶体颗粒小于1𝜇m。此外，商业产品中活菌浓度通常应大于6-7 log10 CFU/g，这意味着需要运载系统有较高的负载能力。益生菌可以被封装在容积较大的药丸或胶囊中，然而正由于这些载体体积太大无法直接通过幽门括约肌，在胃部就被分解，并使得益生菌被释放出来。
图1 益生菌（A，B，C）和冻干后装有益生菌的微凝胶（D）。
第三，许多以前用来包埋益生菌的胶体在食物贮存和通过肠道时未能充分保护益生菌。例如，多孔介质生物聚合物可以让胃酸和酶进入其中并降解益生菌。此外，许多实验室研发的胶体材料成本高、加工难、或成分不适合食品工业，难以实现商业应用。
最后需要注意的是，益生菌输送介质应在结肠内被分解并释放益生菌，从而发挥其益生作用。并且，益生菌应能够附着并定植于结肠内壁，否则会被迅速排出体外。基于上述原因，仍然需要进一步寻求食品级运载材料来有效地封装和运送益生菌。
3益生菌的微胶囊化
3.1 包埋技术
通过多种方式使益生菌胶囊化（颗粒尺寸1-1000𝜇m），可以提高其在消化道中生存能力(图2)。首先，他们可以形成一个物理屏障，使益生菌与周边环境中的胃酸、消化酶等分离开；其次，胶囊也可设计成与（碳水化合物、膳食纤维、蛋白质、脂质或矿物质等有助益生菌存活的）特定营养物质共包裹益生菌；第三，胶囊中可包含添加剂，为益生菌提供更为有利的生存环境，如加入抗酸剂以调节pH值等；最后，精心设计的胶囊还可以收集益生菌排泄物中有利于其生存的特定成分（如保护益生菌免受小肠内胆汁盐侵害的胆汁盐水解酶等）。下面将详细介绍五种胶囊化方法的具体性能。
图2 微胶囊化益生菌在胃肠道中的运输和粘附过程。
微凝胶通常由包含生物聚合物的球形小颗粒组成，微孔由水溶液填充, 在益生菌口服上已得到广泛应用。用于制造微凝胶的材料通常是生物高聚物，如淀粉、海藻酸盐、卡拉胶、明胶、黄原胶和蛋白质等，它们热稳定性、生物相容性高，且毒性和成本较低。其中应用最多的当属海藻酸盐，它是一种从海藻中分离出的多糖，通过静电桥接海藻酸分子上的羧基阴离子与钙离子。研究表明，与未封装的益生菌相比，包裹在海藻酸微凝胶中的乳球菌能更好地应对环境胁迫，从而提高生存能力。藻酸盐微凝胶也被用于益生菌和抗生素协同给药，以防止病原菌产生耐药性。通过乳化再冷冻干燥得到含有B. BB-12的海藻酸微凝胶可以更好地保护益生菌并控制其释放。此外，果胶、淀粉、蛋白质等材料形成的微凝胶也有利于提高益生菌热稳定性和生存能力。微凝胶的性能取决于尺寸大小，太大了可能会影响商业产品的口感并滞留在胃里；但如果太小则难以包埋益生菌，或由于暴露比表面积过大，益生菌降解过快。一项研究表明，微凝胶直径应该小于200𝜇m；但也有其他学者报告称直径应在500𝜇m左右。显然，还需要通过进一步研究来确定微凝胶尺寸对益生菌活性的影响。
通过在表面涂覆一层或多层生物多聚物分子，可进一步提高微凝胶性能。壳聚糖因其正电性而成为最常用的多糖，而其他多数多糖带负电。有研究表明，在模拟胃肠条件下由海藻酸钙和壳聚糖涂层包覆的微凝胶提高了胶囊中益生菌的生存能力。壳聚糖和海藻酸盐都能为结肠内的肠道菌群所降解，所以海藻酸-壳聚糖涂覆后能靶向到结肠释放出益生菌。然而近期一项体外研究发现，与单独使用藻酸盐微凝胶相比，用壳聚糖包覆海藻酸盐微凝胶并不能提高益生菌的生存能力。此外，壳聚糖本身也是抗菌剂，直接涂覆或将影响细菌活性。由纤维素核和海藻酸钙壳组成的核壳微凝胶也被证明可以在胃中保护益生菌，然后在小肠中释放它们。用玉米蛋白包覆海藻酸盐凝胶进行益生菌胶囊化，可以显著提高模拟胃肠道条件下双歧杆菌的存活率。包覆多层电解质的海藻酸盐凝胶可以在通过消化道过程中为益生菌提供保护，20𝜇m的沉积层足以维持凝胶中益生菌活性。
一种生物聚合物可用于构建微凝胶，将两种或多种生物聚合物结合起来以增强其性能则更为有利。这种结合是以凝聚作用的方式将带负电荷与带正电荷的生物聚合物混合起来。复合凝聚物具有较高的细胞聚集效率、良好的扩展性和更为有利的性能，还可以被设计得更有助于益生菌从生物聚合物微凝胶中完全释放。研究者尝试了不同的生物聚合物组合:乳清分离蛋白/阿拉伯树胶(WPI / GA)、WPI / GA /海藻酸盐、明胶/ GA 、明胶/海藻酸盐和淀粉/海藻酸盐。静电络合形成的海藻酸-明胶微凝胶包埋益生菌后，可以提高其在高温、长期储存及消化道中的存活率。图1D显示了微凝胶经冷冻干燥后的电子显微镜图像，微凝胶的保护作用取决于以下特性：明胶是具有缓冲能力的蛋白质，可以提高益生菌在胃中的稳定性；海藻酸盐/明胶微凝胶中的生物聚合物或可有效地阻止消化酶在其内部的扩散。海藻酸-淀粉微凝胶也可以提高益生菌(干酪乳杆菌)在模拟胃肠道条件下的生存能力，玉米淀粉和海藻酸盐组合的微凝胶不仅保护了益生菌，还提供了一种可能提高益生菌活力的益生元(淀粉)。最近，另一种载有益生菌的微胶囊利用转胺酶在明胶的两个氨基酸残基之间形成分子内和分子间共价交联，显著提高了嗜酸乳杆菌的抗逆性和活性。
另一种提高益生菌活性的胶囊化方式通过控制微凝胶的孔径和内部pH值来实现。暴露在酸性强并充满消化酶的胃液环境中会使许多益生菌失活，若能在胃里使微凝胶内部pH值保持中性并且不被消化酶渗入，就能减少这种影响从而维持益生菌活性。因为生物聚合物的孔径比较大，氢离子(H+)和消化酶易于扩散到胶囊内部从而促使益生菌降解，所以单是微凝胶很难在胃环境中保护好益生菌。如海藻酸盐微凝胶的孔隙尺寸约为17纳米，比氢离子（< 1nm）或酶（< 5nm）的尺寸要大得多。研究表明，将不溶性抗酸剂氢氧化镁、碳酸钙或氧化镁掺入海藻酸盐微凝胶中可以在其内部保持中性pH值，从而大大提高胶囊化益生菌在胃环境里的稳定性。这些抗酸剂在中性pH值下不溶于水，但在酸性条件下会溶解，释放出羟基离子中和氢离子，从而保持恒定的中性pH值(直到它们完全溶解)。在模拟胃环境条件下，将微凝胶与纤维素纳米颗粒掺杂可以通过填充孔隙从而减少胃酸的进入，显著提高益生菌的抗逆性。最近开发出的由钙、海藻酸盐和EDTA混合物组成的pH响应载体颗粒在酸性条件下呈凝胶状，在中性条件下分解，这种材料也可用于在胃中保护益生菌，而后在小肠中将其释放。
还有一种提高益生菌活性的胶囊化方式是为其提供充足养分，或称益生元。将益生元包埋在微凝胶中可以提高益生菌活性，而不会对其释放产生不利影响。益生元是难以消化或只能部分消化的成分，可以促进益生菌在人体肠道内生长。如低聚糖（𝛽-葡聚糖及其他植物提取物）通常不被消化酶分解，但可以被一些细菌利用，特别是结肠中的乳酸菌。用低聚糖胶囊化发酵乳杆菌可以辅助益生菌在低温下生存。将沙棘提取物加入微凝胶中也可以帮助益生菌抵御热处理和消化道中不利环境条件，这是主要归功于其抗氧化活性以及对微凝胶大小和形状的影响。
3.2 涂覆技术
涂覆技术也可以帮助益生菌提高生存能力，此时单个益生菌细胞将被包裹上一层涂料，而非将多个益生菌细胞嵌入某种基质(如微凝胶)中。涂覆技术特别适用于提高益生菌的黏附力。以往研究多集中于微胶囊在增强益生菌存活率方面的作用（图3），很少有研究关注益生菌在结肠粘附并定植的过程。益生菌在结肠中释放后，强大的黏附特性使其能够附着在肠粘膜上。用于封装益生菌的微凝胶在尺寸上有很大的差异，直径从几十到几千微米不等，所以它们在肠腔内的滞留时间可能也有很大差异：尺寸越大，滞留时间越短。
图3 原子力显微镜下微凝胶和经冷冻干燥后微凝胶的表面粗糙度。
提高益生菌黏附力的若干方法中，前景最好的是采用逐层静电沉积法，将带相反电荷的生物聚合物依次沉积在益生菌表面。该方法导致益生菌周围形成纳米生物聚合物涂层，已被用于将单个益生菌包裹在2-10层生物聚合物中，每层厚度约为4-5 nm。用这些生物聚合物涂层覆盖微生物细胞可以提高它们的生存能力，并改善它们的黏附特性。典型的食品级生物聚合物为多糖或蛋白质，如海藻酸盐、果胶、淀粉、明胶和乳清蛋白。整个制备过程可以在相对温和的条件下进行，减少了对益生菌活性的破坏。通过这种方法将壳聚糖/海藻酸盐双层膜包覆在益生菌(凝固芽孢杆菌)上，可以提高其在消化道中生存能力；与游离细胞相比，被包覆的微生物黏附性更强。此外，壳聚糖/海藻酸盐包覆膜的层数对存活率也有影响：单层膜对益生菌的保护效果不如双层膜，而三层膜包裹菌体可使微生物的指数生长期延缓10小时。然而，要想实现商业应用仍需要进一步研究以提高方法的有效性，特别是需要填补实验室规模和工业生产益生菌制剂之间的差距。文献中报道的许多方法由于各种原因不适合商业应用：制备成本高、工艺复杂、在实际产品的加工和储存条件下失效，或者对食物的外观、质地等产生负面影响。这些问题需要在今后的研究中系统性地加以解决。
4 评估益生菌微胶囊化方法的有效性
开发出新方法后，对其结构、物理化学性质、功能和益生菌活性的评价研究就变得至关重要，这通常是通过体外和体内模型相结合来实现的。体外模型有助于经济快速地筛选大量配方，但无法准确地模拟人类肠道内发生的复杂过程。体内模型更昂贵且耗时，但为方法实际应用时的性能提供了一个更准确的评估。
4.1 体外模型
微凝胶的结构常使用光学或电子显微镜来进行表征，原子力显微镜(AFM)也可以用来提供有关微凝胶表面形貌的相关信息，例如冻干微凝胶的表面粗糙度如图3所示。其他方法如荧光染料标记后可以观察到用于组装微凝胶的生物聚合物。荧光染料可用来测量微凝胶内部的pH值：水溶性染料(荧光素四甲基罗丹明糖酐)加入到微凝胶中后，共聚焦显微镜可以根据荧光强度测量来监测内部pH值。荧光染色也被用于检测微凝胶中益生菌的位置和活性：用细菌活力试剂盒检测益生菌的活力时，荧光染色的死细胞呈红色，而活细胞呈绿色，因此可以通过共聚焦显微镜或流式细胞仪检测活细胞与死细胞的比例。被包埋的益生菌可以使用SYBR Green I核酸染色法进行标记以测定微凝胶内的细胞分布。益生菌还可以通过加入发光质粒进行检测，该质粒允许成像系统检测出活性益生菌。这种生物发光质粒的优势在于可以用来追踪益生菌通过肠道的过程，并监测益生菌的增殖情况。小鼠灌胃2小时后标记的大肠杆菌菌落原位成像如图4所示，该方法的主要缺点之一是目前不适用于革兰氏阳性菌，而大多数益生菌都是革兰氏阳性菌。
图4 （A）标记的感受态大肠杆菌菌落；（B）小鼠灌胃2小时后标记的大肠杆菌菌落。
为了解益生菌负载方法的有效性，应对益生菌在胃肠道运输过程中的耐受性进行评估。根据国际标准化组织ISO的描述，可以使用平板计数法或流式细胞仪测定益生菌的活性。体外模型有静态和动态消化两种分析方法，静态模型使用恒定的食物与消化液（包括模拟唾液、胃液和肠液）比例，每个消化步骤pH值恒定；动态模型（如SHIME，图5A）可以调节pH值，控制食物流动，注射消化酶，更有利于准确模拟实际消化过程。一种计算机控制的体外胃肠模型——动态胃肠模拟器被用于模拟胃、小肠以及结肠区域的生理过程。当研究中只关注结肠微生物代谢时，可以将小肠内容物送入结肠，利用体外模型研究益生菌的生长和活动特征（图5B）。最近，一种叫做“最小肠道”的体外胃肠模型被开发出来，维持pH值、温度、胆盐、菌群和酶成分在实际生理水平并用以模拟人类小肠。
图5 动态体外消化模型：（A）模拟胃1、小肠2、升结肠3、横结肠4、降结肠5；（B）多室模型。
4.2 体内模型
体外模型对于快速筛选很实用，但不能准确地模拟人体肠道，所以备选的益生菌胶囊化方法应该用更精确的体内模型进行测试。实时PCR和荧光原位杂交等几种分子生物学方法已被用于检测胶囊化益生菌口服后的活性。有趣的是，有时体外和体内研究之间的相关性很差。例如，牛奶蛋白胶囊化后并没有提高益生菌在小鼠胃肠道系统中的存活率，尽管它们在体外研究中被认为可以提高存活率。相反，在另一项研究中，改性多糖制备的微凝胶同时增强了益生菌在体外模型和小鼠模型中的生存能力。显然，还需要更详细的体内研究来探讨胶囊化益生菌在胃肠道内的转化规律。
胶囊化对益生菌性能的影响也用其他动物模型进行了评估。诱导结肠炎的小鼠被喂食游离或胶囊化的益生菌，并被测量其肠道炎症程度。结果表明，胶囊化的益生菌比游离益生菌更能有效预防肠道炎症。另一项研究发现，口服马铃薯淀粉胶囊化的益生菌可通过强化粪便排泄作用显著降低铅毒性。虽然啮齿类动物（特别是大鼠和小鼠）通常被用来测试益生菌，但应该注意的是，它们的肠道菌群与人类的肠道菌群并不十分相似。相反，狗和人有相似的胃的形态特征，而猪和人有相似的结肠形态。因此在后续研究中，使用这些动物能够获得更有说服力的实验数据，尽管成本更高且伦理问题更多。
结论
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