现如今，实时荧光定量PCR技术（以下简称qPCR）在传染病检测、动物疫控、药物基因组学和生殖遗传等等应用领域已经成为一颗耀眼的明星，这些应用领域都是借助qPCR检测核酸靶标进行定性或者定量实验。现实应用中，种类繁多的国产试剂盒（荧光PCR法）在这些应用中发挥着巨大的作用。
在支持我们的仪器使用过程中，经常被老师问到：“这个基线到底有什么含义，我需要调吗？说明书给的很灵活呀”，或者“阈值线怎么调呢？”，又或者“您帮忙看看这个曲线像S型扩增曲线吗？” 等等诸如此类的问题。总结分析这些问题的用词，发现都是围绕“S型扩增曲线”、“基线”、和“阈值线”这三个关键词展开来的，还有一个“CT值”（也叫Cq值）。非常凑巧，这四个词高频地出现在各大厂商的试剂盒说明书中。今天在这里和大家一起解释一下这四个词在Applied BiosystemsTM品牌（以下简称AB品牌）实时荧光定量PCR平台上的含义，若能让您使用AB品牌实时荧光定量PCR仪器更加顺手，让您的工作更加简单，那就最好不过了。在您接着往下看之前，需要特别声明一下，解释上述四个词的概念是从AB品牌实时荧光定量PCR仪器平台的角度出发的，涉及到这四个词在您所用的检测试剂盒中如何具体理解时，建议一定要和试剂盒厂家联系并确认，因为试剂盒厂家对自己的试剂盒产品拥有绝对的解释权。看着像“S”形状不就对了吗？这个比较好理解吧。其实不然，这只是其表象。可以说，“S型扩增曲线”应有两个特征：
图1 线性图谱（Linear）、对数图谱（Log）和多组份图谱（Multicomponent Plot）线性图谱和对数图谱是扩增曲线图谱（Amplification Plot）的两种展示形式，多组份图谱保留了扩增曲线的原始形态，扣掉基线之后，就形成了前面两种图谱。// 2. 曲线上可观察到基线期、指数增长期、线性增长期和平台期（如图2）这一点才是知其然，知其所以然的关键点。在基线期，PCR反应刚刚开始，受到背景信号的影响，荧光信号没有明显的变化，似一条直线，如图2中浅蓝色标记。随着循环数不断增加，PCR反应累积的荧光信号量超过了背景信号，就进入了指数增长期，这时，DNA聚合酶活性还很高，dNTP也很充足，引物探针也非常充足，所以，PCR产物增加接近理论的2倍，荧光信号增加同样也约为2倍，因此，指数增长期是符合PCR理论方程的。在线性图谱中，曲线向上迅速抬起，在对数图谱中，曲线斜向上增长，似一条直线，如图2中浅红色标记。随着循环数继续增加，就进入了线性增长期，随着DNA聚合酶活性下降，dNTP和引物探针变得不再充足，这时的PCR产物增加不再是2倍，而是小于2倍，且倍数不断地在降低，如图2中浅灰色标记。最后随着循环数的增加，荧光信号几乎没有变化，就进入了平台期，如图2中浅棕黄色标记。图上分别用四种颜色标识出“基线期”、“指数增长期”、“线性增长期”和“平台期”。有时扩增曲线起峰很晚，可能无法观察到平台期，甚至线性增长期。实际上，查看“S”型扩增曲线，建议还要在Multicomponent plot（多组份图谱）里查看，而非仅在Amplification plot（扩增曲线图谱）中查看。这是因为，Amplification plot里展示的扩增曲线，是由Multicomponent plot里展示的扩增曲线经过扣除基线（Baseline）之后转换得来的，若再加上坐标轴的变化，可能会让一些扩增曲线在Amplification plot里变得有些夸张，非常形似字母“S”，但是若查看Multicomponent plot，就可能波澜不惊，近似一条直线。请注意，日常中，有许多扩增曲线观察不到平台期，甚至有时看不到线性增长期，如图3，但依然可以将曲线顺势延伸出去（虚线部分，请注意：此非软件自带功能），从而呈现“S”型扩增曲线（这可能由于核酸加入量低，或者核酸中有抑制剂等原因，导致扩增起峰较晚，“S”还未成型，扩增程序就结束了。）
请注意：虚线部分为模拟的，非扩增曲线真实的部分，虚线延伸部分非软件自带功能基线是指PCR最初的一些循环，且循环之间的荧光信号几乎没有变化，似一条直线。基线一般由软件自动划定。那么，基线到底在定义什么呢？以图3为例，从第1个循环到第32个循环之间，差不多为一条平直的线，这是实际情况，但是从PCR反应的理论角度来讲，从第一个循环开始就有PCR产物产生，就对应有荧光信号释放，那为什么直到第33个循环之后才开始有较为显著的、向上抬升的信号呢？这是因为前32个循环释放的荧光信号都被背景信号遮盖了，这个背景信号主要来自反应管中的反应体系。随着PCR循环继续进行，累积的荧光信号超过背景信号，这就进入到了扩增曲线上的指数增长期（曲线有明显向上抬升），然后就再有线性增长期，平台期（有时可能看不到，如图3的虚线部分）。扣掉了这个背景信号之后（软件自动完成），就有了您经常看到的扩增曲线图谱（Amplification Plot）。要准确理解阈值线，就需要先了解什么是阈值。阈值是指扩增曲线图谱纵轴上的一个点，它代表了一定的荧光信号值，然后通过此点，画一条平行于横轴的线，此线可称之为阈值线。阈值线一般也由软件自动划定。遇到特殊情况需要手动调整时，就需要遵守核心的原则之一：阈值线与S型扩增曲线的交点一定位于指数增长期。那么针对线性图谱和对数图谱怎么来理解呢？线性图谱建议放在刚抬升的区域（如图4所示红色区域），一般要高于基线；对数图谱建议放在直线区域（如图4对数图谱中蓝色的直线，与该直线平行的区域即为直线区域，也就是指数增长期啦）。实际工作中，若需手动调整阈值线，请详细与试剂盒厂家进行沟通，因为有的试剂盒说明书中还要求阈值线要高于阴性质控品的扩增曲线，也要参考阳性质控品CT值的大小范围等等。
图4 阈值线设置示例 图示为软件默认的阈值线
阈值线与S型扩增曲线有个交点，且位于S型扩增曲线的指数增长期，该点对应到横轴上，会得到一个循环数，即为CT值。也就是说CT值易受到阈值线的影响，阈值线向上移动，CT值变大；阈值线向下移动，CT值变小。实际工作中，有时会遇到样本处于临界阳性判断的情况，也就是CT值稍稍低于或高于阳性判断的阈值，易受到阈值线调整的影响。遇到这种情况，建议不要过多纠结阈值线调节，应该去查看其它因素，例如，如果有内参基因，看看内参是否扩增正常，若它的CT值相对其他核酸样本很大，那可能是核酸加入量少，或是核酸中有抑制剂；若是有外参基因（一般用来监控核酸提取过程、以及PCR反应扩增是否正常），若扩增正常，说明核酸提取流程正常，PCR反应无抑制剂，有可能是采样问题。以上跟大家介绍了“S型扩增曲线”、“基线”、“阈值线”和“CT值”的相关情况，希望能为您日常数据分析提供一些思路，但是在实际操作中，切不可照本宣科，需因地制宜。遇到数据结果不确定时，也多与使用的检测试剂盒厂家商讨，或者使用另外一个品牌的试剂盒做对比验证。
