科研丨 SR：低蛋白饮食对小鼠肠道微生物群的影响

编译：艾奥里亚，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

肠道微生物菌群会造成蛋白质缺乏的现象，本研究通过动物实验探究了低蛋白日常饮食对肠道微生物菌群组成的影响。在为期4周的实验中，在给定的无特定病原体（SPF）的小鼠喂饲四种不同蛋白质浓度的饲料（3、6、9或12%蛋白质）中的一种，其中喂食3%蛋白质饲料的小鼠出现蛋白质缺乏的症状，包括体重减轻和血清尿素氮浓度降低。基于16S rRNA基因测序，本研究探究了3%和12%蛋白质饲料组在0、7、14、21和28 d时的小鼠的肠道微生物菌群组成，通过研究我们揭示了肠道微生物菌群的差异。在整个研究过程中，我们在3%蛋白质饮食组小鼠的肠道内检测到更多产脲酶的细菌类别，而在12%饲料蛋白质饮食组中，小鼠肠道内Streptococcaceae和Clostridiales科的丰度有所增加。这些结果表明蛋白质的缺乏可能与肠道微生物菌群的改变有关。

论文ID

原名：The influences of low protein diet on the intestinal microbiota of mice
译名：低蛋白饮食对小鼠肠道微生物群的影响
期刊：Scientific Reports
影响因子：3.998
发表时间：2020.10.13
通讯作者：Hiroaki Masuoka，Wataru Suda
通讯作者单位：东京大学（The University of Tokyo），RIKEN综合医学中心（RIKEN Center for Integrative Medical Science）

Web results那不勒斯腓特烈二世大学

实验设计

第一组试验：所有的小鼠（n=20）均采用商用固体饲料（NMF）驯化1周。随后，我们根据体重将小鼠随机分为四组，分别饲喂3、6、9或12g/100g干重的蛋白质日粮。每组每周测量食物和水的消耗量。喂养实验4周后，用二氧化碳安乐死小鼠。实验第28天放血时采集全血，1500 g离心15 min，血清标本保存在-80°C以用于后续分析。

第二组试验：另外20只被驯化的小鼠，随机分成四组，与第一组实验中的情况相同。每周单独测量体重，每组每周测量食物和水的消耗量。喂养实验4周后，用二氧化碳安乐死小鼠。实验周期中，每隔7天（第0、7、14、21、28天）直接从3%和12%蛋白质饲料组的每只小鼠身上采集粪便样本，然后保存在-80°C中，用于后续16S rRNA基因测序。

结果

1 体重，饮食和用水量
在两个独立的实验中我们分别记录了体重，食物消耗量以及水的消耗量：一个是为了探究饮食中蛋白质营养的影响（第一组试验），另一个主要关注于饮食中蛋白质含量与小鼠肠道微生物菌群之间的关系（第二组试验）。
在试验一中，在28 d时，饲喂3%蛋白质组别的小鼠的体重显著低于饲喂6%蛋白质的组别（Tukey - Kramer检验P=0.048），对于其他组别而言，在第14 d之后，饲喂3%蛋白质的组别的体重同样低于饲喂9%蛋白质的组别（Tukey - Kramer检验第14、21、28天的P值分别为0.028、0.038和0.013），以及饲喂12%蛋白值的组别（Tukey - Kramer检验第14、21和28天的P值分别为0.0034、0.0026和0.0002）。在整个实验期间，6%、9%和12%组的小鼠的体重差异不显著。在第28天，饲喂3%蛋白质的小鼠的相对体重下降到96.4±2.5%，而饲喂12%蛋白质的小鼠的相对体重增加到120.6±2.5%。在第二组实验中，各组动物的体重如图1所示。本组实验中的体重数据与第一组实验中的数据具有相似的趋势。第2组试验中，饲喂3%蛋白质组的小鼠的体重显著低于饲喂6%蛋白质组的小鼠（经Tukey - Kramer检验，第7，14，21，28天两组P值分别为0.0304，0.0002，2.67*10-5和2.04*10-5），以及饲喂9%蛋白质组的小鼠（Tukey - Kramer检验第7，14，21和28天的P值分别为0.0073，0.0001，1.52*10-5和9.14*10-7）和饲喂12%蛋白组的小鼠（Tukey - Kramer检验第7，14，21和28天的P值分别为0.0131，2.30*10-5，4.26*10-7和3.48*10-8），在整个试验期内，饲喂6%、9%和12%蛋白质组小鼠的体重差异不显著。在第28天时，3%蛋白质组小鼠的相对体重下降到77.1±2.1%，而12%蛋白质组的小鼠的相对体重增加到115.4±2.0%。

图1 第二组实验为期4周内小鼠体重的变化。不同组别饲喂不同浓度的蛋白质（n=5）；图中不同字母代表在相同时间下，经Tukey–Kramer检验后各组别之间无显著性差异。

在营养和微生物菌群的研究中，我们均记录了每个饮食组消耗的水和食物的量。在第一组实验中，四组之间就食物消耗量而言没有差异，但饲喂3%蛋白质组的耗水量高于其他组。在第二组实验中，不同组别之间的水和食物消耗量如图2所示。在该组实验中，所有饮食组的食物消耗量之间无显著差异（图2a），而饲喂3%蛋白质组的耗水量同样高于其他组别（图2）。在第28天时，3%蛋白质组的耗水量是12%蛋白质组的两倍之多。

图2 第二组实验中喂食不同蛋白质饮食的小鼠的食物和水分摄入量变化。其中1st week，2nd week，3rd week，4th week分别代表试验周期1-7，8-14，15-21，22-28天。a代表不同组别小鼠每周食物用量；b代表不同组别小鼠每周水分用量。

2 血清生物标志物
试验结束时（第28 d），饲喂3%、6%和9%蛋白质的组别的小鼠的血清BUN显著低于饲喂12%蛋白质的组别（经Tukey - Kramer检验，P值分别为1.77×10-5，0.006和0.002）。其中，3%蛋白组在28 d时其血清BUN浓度也显著低于6%蛋白组（P=0.034）。试验结束时（第28 d），各组间血清白蛋白、总蛋白和A/G比值均无显著性差异（P>0.05）。
 
3 肠道微生物多样性
图3显示了在0、7、14、21和28天时，饲喂3%和12%蛋白质组的小鼠的肠道微生物菌群α多样性指数箱线图。在整个实验过程中，3%蛋白质组的OTU数、Chao1、ACE指数以及Shannon指数无显著差异，而12%蛋白组第28 d的Chao1和ACE显著低于第0 d（P=0.032）。12%蛋白组在第7、14、21、28天的Shannon指数均显著低于第0天（P<0.05）。在整个实验过程中，对饲喂3%和12%蛋白质的饮食组小鼠肠道微生物菌群组成进行加权和未加权主坐标分析（PCoA）（图4），我们发现，在饲喂3%蛋白质的组别中，基于加权UniFrac距离的多变量方差分析（PERMANOVA）揭示了该组别中其0 d与其他时间节点具有明显不同之处，具有统计学差异（0 d与7 d之间R2=0.840，P=0.11；0 d与14 d之间R2=0.916，P=0.11；0 d与21 d之间R2=0.921，P=0.11；0 d与28 d之间R2=0.807，P=0.11）。此外，饲喂12%蛋白质的组别，其0天与其他时间节点同样具有显著性差异（0 d与7 d之间R2=0.795，P=0.021；0 d与14 d之间R2=0.861，P=0.021；0 d与21 d之间R2=0.769，P=0.021；0 d与28 d之间R2=0.861，P=0.021）。

图3 饲喂3%和12%蛋白质饮食的小鼠肠道微生物菌群的ɑ多样性的分析。途中*代表组别之间具有显著性差异；a-b分别代表3%和12%组小鼠的OTU数箱线图；c-d分别代表3%和12%组小鼠的Chao1指数箱线图；e-f分别代表3%和12%组小鼠的ACE指数箱线图；g-h分别代表3%和12%组小鼠的Shannon指数箱线图。

图4 饲喂3%和12%蛋白质饮食的小鼠肠道微生物菌群的β多样性的分析。a代表第二组实验中，基于加权的小鼠肠道微生物组成的主坐标分析（PCoA）分析；b-c分别代表基于PERMANOVA分析下3%蛋白组（b）和12%蛋白质组（c）在加权Unifrac距离分析中的差异，其中R2表示测定的一致性，加粗代表具有显著性差异。

4 肠道微生物组成
进一步，我们对不同时间节点的小鼠肠道微生物菌群组成进行了比较分析（在任意一个组别中丰度>0.1%时纳入分析研究范围）（图5a）。其中，饲喂3%蛋白质组的小鼠在第14、21、28天时，其Actinobacteria的比例显著高于第0天（P值分别为0.032、0.032、0.032）。在第7、14、21和28天，Bacteroidetes所占比例均显著低于第0天（P=0.032、0.032、0.032和0.032）。然而，Firmicutes所占比例在第7天时显著高于第0天（P=0.032），而第14、21、28天时却显著低于第0天（P=0.032、0.032和0.032）。14、21、28天Proteobacteria所占比例均显著高于0天（P=0.048、0.032和0.048）。28d时Tenericutes所占比例明显低于0天（P=0.032）。另一方面，在饲喂12%蛋白质组中，其第14天和第21天的Bacteroidetes所占比例均显著低于第0天（P=0.032和0.032），而Firmicutes所占比例显著高于第0天（P=0.032和0.032）。Proteobacteria所占比例在第7、14、21和28d均显著高于第0天（P=0.048、0.032、0.032和0.032）。在整个实验过程中，Actinobacteria的比例没有明显变化。
图5 饲喂3%和12%蛋白质饮食的小鼠粪便中检测到的主要肠道微生物菌群组成。a-b分别代表在门水平（a）以及属水平下（b）微生物的相对丰度。
同时我们同样在属水平上进行了分析（在任意一个组别中丰度>0.1%时纳入分析研究范围）（图5b）。在饲喂3%蛋白质组的小鼠肠道中，Acinetobacter，Enterobacter以及Enterococcus的比例在第28天时显著高于第0天（P=0.032）。21天和28天时Microbacterium的比例明显高于0天（P=0.032和0.032）。第14、21、28天的Corynebacterium所占比例显著高于0天（P=0.032、0.032、0.032）。7d、14d、21d和28d的Jeotgalicoccus的比例显著高于0天（P=0.032、0.032、0.032和0.032）。Staphylococcus所占比例在第7天时显著高于0天（P=0.032）。Citrobacter所占比例在第14天和第21天时显著高于第0天（P=0.048和0.032）。Lactobacillus，Lactococcus以及 Muribaculum的比例在第0天时显著高于第7、14、21和28天（P=0.032、0.032、0.032和0.032），而Bacteroides的比例在4个时间节点内也发生了变化（P分别为0.048、0.048、0.032和0.048）。Dorea所占比例在第0天时显著高于第14、21和28天（P=0.048、0.048和0.032）。另一方面，在饲喂12%蛋白质饲料组中，Dorea，Lactococcus以及Streptococcus所占比例在第0天时显著低于第7、14、21和28天（P=0.032、0.032、0.032和0.032）。Citrobacter（P=0.048、0.032、0.032和0.032）以及Enterococcus（P=0.048、0.048、0.048和0.032）所占比例在第7、14、21和28天的变化规律相同。Atopostipes所占比例在第0天时显著高于第21天和第28天（P=0.048和0.032）。Bacteroides的比例在第0天时显著高于第28天（P=0.032）。图6则是以热图的形式代表了所选OTU的丰度（在为期28天的实验中，在任意一个组别中丰度>0.1%时纳入分析研究范围）。所选OTUs的总平均丰度为90.4 ± 1.10%。
图6 在任意一个组别中丰度>1%的OTUs聚类分析热图。

讨论

本研究探讨了低蛋白饮食对雄性SPF小鼠肠道菌群组成和营养状况的影响。我们只使用雄性小鼠来消除与性别相关的影响，从而确保分析的重点是与营养差异相关的肠道微生物菌群变化。饲喂3%蛋白质饲料的小鼠表现出蛋白质缺乏的迹象，如生长迟缓和血清BUN降低。在整个实验过程中，由于四组不同组别在食物消耗方面无显著差异，因此在3%蛋白质组中观察到的体重下降不是由食物消耗量的减少所引起的。有趣的是，3%蛋白质组的耗水量明显高于其他组。尽管我们的研究结果与其他研究人员的结果有些出入，但我们有关与食物消耗的结果Larson等人的结论一致。基于之前的研究我们并未得出一种普适性规律，这可能是由于实验小鼠的年龄、性别和品种上的差异所导致的。本研究中，我们证明了喂食低蛋白质摄入量的小鼠消耗更多的水。通过查阅文献我们发现，本研究首次探究了蛋白质摄入量与水摄入量之间的相关关系。
已有报道表明，在低蛋白饮食条件下，大鼠血浆白蛋白水平在某些时间点有下降趋势。另一方面，有研究学者发现，在为期4周的饲喂实验后，低蛋白饮食对血浆白蛋白水平无显著影响（在空白组和实验处理组之间无显著差异）。本研究结果与这些先前的研究一致。
在本研究中，在第0天，饲喂3%和12%蛋白质的组别之间小鼠的肠道微生物组成存在差异，但在第0天，3%和12%蛋白组之间的UniFrac距离差异显著低于其他时间点。尽管在0天时的差异可能与饲养环境相关，但随着试验的进行，我们认为，本研究中检测到的微生物菌群的变异主要受饮食变化的影响。伴随着饮食变化的微生物群改变可能不仅包括营养方面的差异，而且还包括宿主系统的变化，如体重减轻。在饲喂3%蛋白质的条件下，10种优势OTUs的比例增加，这其中包括：Staphylococcuslentus，Citrobacteramalonaticus，Enterococcusfaecalis，Jeotgalicoccus sp.，Corynebacterium stationis，Staphylococcus nepalensis，Enterobacter ludwigii，Acinetobacter sp.，Enterococcus gallinarum以及Microbacterium maritypicum。在这些OTU中，包括E. ludwigii，M. maritypicum，C. amalonaticus，C. stationis，S. lentus以及S. nepalensis在内的6个OTUs已被认为具有脲酶活性，该酶可以催化尿素水解生成二氧化碳和氨。据报道，肠道细菌在产生充足的脲酶时，会将上皮细胞分泌的胃肠道尿素分解为氨和二氧化碳，一些细菌利用氨气产生氨基酸和肽。而宿主既可以吸收细菌合成的氨基酸，也可以吸收细菌合成的多肽。这种被称为“尿素氮补救（urea nitrogensalvage）”的途径主要由产脲酶和氨利用细菌所引起。众所周知，尿素产生的氨的吸收及其回收转化为氨基酸这一过程主要发生在宿主机体水平上，因此在下一步研究中，需要进一步的研究来澄清微生物菌群对宿主氮平衡的贡献。
在饲喂12%的蛋白质饲料组中，8种优势OTUs的相对丰度有所上升，这8总OTUs分别包括Streptococcus sp.，Lactococcus lactis （2 OTUs），Longibaculum muris，Clostridiales bacterium，Candidatus Dorea massiliensis以及Lachnospiraceae bacterium （2 OTUs）。在这8个OTUs中，包括L. lactis和Streptococcus sp.在内的3个OTUs归属于Streptococcaceae科，而其余5个归属于Lachnospiraceae科。注释在Streptococcaceae的OTUs在3%蛋白质组同样有所增加，但在12%蛋白质组中显著增加。12%蛋白质日粮组中高比例的L. lactis可能与饲料组成有关。用于适应NMF饲料的蛋白质来源主要以植物和动物为基础；而3%和12%蛋白质饲料的蛋白质来源是酪蛋白（来自哺乳动物牛奶），而Lactococcus可能在实验性饮食中受到酪蛋白的青睐。
同样有几点限制需要被提及。首先，我们没有通过饲喂商用固体日粮（含有27.5%的蛋白质）作为对照组。我们的目的是比较“含有足够量蛋白质的饮食”和“蛋白质缺乏饮食”所产生的影响，而我们认为商业饮食中则包含了过量的蛋白质。因此，在本研究中，12%的蛋白质饮食更恰当地代表了“一种含有足够量蛋白质的饮食”。其次，观察了基线时3%组和12%组之间肠道微生物菌群的差异；我们试图将单个小鼠随机分组，以便在每种饮食下的平均体重具有可比性。基线差异的原因可能是各笼小鼠肠道菌群在此期间发生了非方向性的变化。为了验证试验期间肠道微生物菌群的这种变化是否导致实验第0天笼间肠道微生物菌群不一致，我们计算了3%蛋白组（n=5）、12%蛋白组（n=5）、3%和12%蛋白组（n=10）小鼠之间基线时的加权UniFrac距离。通过分析我们发现，3%和12%蛋白质组小鼠肠道菌群的不一致性与仅用3%蛋白质组和12%蛋白质组小鼠的肠道菌群不一致性无显著差异。换句话说，3%蛋白质组和12%蛋白质组之间的肠道微生物菌群在基线时的差异与在每组中观察到的差异相当。
肠道微生物群与其宿主处于共生关系中。已有的研究表明，饮食的营养成分的变化可以通过肠道微生物群改变来影响宿主的健康。在本研究中，我们检测了饲喂3%和12%蛋白质组的小鼠的肠道微生物群的特征变化。具体来说，在3%的组中，我们检测到几种细菌物种丰度的增加，这些细菌物种被认为与“尿素氮不就”相关。而在下一步的研究中，应该进一步探究肠道微生物与蛋白质摄入之间的相关关系，着将有助于解决与人类营养不足有关的挑战，特别是在低收入国家。

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