荧光PCR检测霍乱弧菌流程与方法
霍乱弧菌是引起人类霍乱的病原菌.也是我国传染病防治法规定的甲类传染病病原之一作为国际检疫传染病——霍乱的病原诊断.以检出O。群霍乱弧菌或O。剪群霍乱弧菌为准。O.群霍乱弧菌可再分为古典生物型和埃尔托生物型埃尔托霍乱弧菌在外环境水源中长期存在.特别是在水体PH值为7.6—8.5、水温26—32cI=、氯化物260—278mg／L的条件下抵抗力强.生长良好。水体及水产品中的甲壳类、贝壳类、鱼类及两栖类水生动物(牛蛙、蟾蜍)等易受霍乱弧菌的污染。
1样品、材料和仪器1.1样品为水样和鱼
1.2营养肉汤、营养琼脂、碱性蛋白胨水、PH8.4的庆大霉素琼脂培养基来源于北京陆桥技术有限责任公司。
I.3霍乱O。群多价诊断血清、小川型血清、稻叶型血清、O。剪群血清为兰州生物制品研究所产品。
1.4API20E编码及配套生化反应板为法国生物一梅里埃公司的产品。
1.5霍乱弧菌O，菌群实时荧光PCR检测试剂盒及霍乱弧菌通用型实时荧光PCR检测试剂盒为深圳太太基因工程有限公司研制
1.6荧光PCR仪：博日FQD一33A2操作步骤
2.1细菌的分离培养、玻片凝集及血清分型严格按照SN／T1239—20o3《国境口岸霍乱检验规程》来进行。
2.2API鉴定将营养琼脂平板上的纯菌落用API20E试验条进行鉴定根据说明表读反应.参照鉴定表、分析图索引和APILAB软件得到鉴定结果。
2.3实时荧光PCR检测霍乱弧菌按照深圳太太基因工程有限公司提供的试剂盒方法来进行。
2.3.1增菌液处理(样本处理区)取待测样本增菌液lml到1.5Hll无菌离心管中.8000rpm离心5min，尽量吸弃上清：加入50ulDNA提取液，混匀后沸水浴5min.13000rpm离心5min.取上清保存于一20cI=备用以待检测
2.3.2扩增试剂准备(PCR前准备区、从试剂盒中取出PCR反应液.室温融化并振荡混匀.取出Taq酶及UNG酶.第一次使用时2000rpm离心10s.以收集粘在管壁上的酶贮液设所需要的PCR反应管管数为nfn=1管阴性对照+1管阳性对照+样本数1，每个测试反应体系配制如下表：表1测试反应体系配制堕型垦生!竺璺竺用量(u1)22，50.50,06计算好各试剂的使用量.加入一适当体积离心管中.颠倒混匀.2000rpm离心10s.向设定的n个PCR反应管中分别加入23u1..转移至样本处理区。
2.3.3加样(样本处理区)向所设定的n个PCR反应管中分别加入2.4.1中处理过的样本各2ul，阴性对照、阳性对照解冻后取2ul加入相应的反应管中.盖紧管盖.将PCR反应管转移至检测区.置于PCR仪上.记录样本摆放顺序。
2.3.4PCR扩增(检测区)37cI=：5min，1个循环；95cI=：3min，1个循环：95cI=：5s，60cI=：40s(收集荧光)，40个循环。反应体系设为25ul。
2.3.5结果判断
2.3.5.1检测样本Ct值≤35.0时.测定结果可直接报告为样本阳性：
2.3.5.2检测样本35.0≤Ct值<40时，重复一次.如果Ct值仍小于40，且曲线有明显的对数增长期.可报告样本阳性.否则报告样本阴性
2.3.5.3检测不到样本Ct值.报告样本阴性3实验结果在水产品样品中分离出一株霍乱弧菌(菌株号为ZS0501)、在水样中分离出两株霍乱弧菌(菌株号为ZS0502、ZS0503)，以下为三株菌株的各项实验结果3.1细菌形态特征分离的霍乱弧菌菌株都为革兰氏阴性、无芽胞、无荚膜的短小杆菌。菌落直径约1mm——3mm，呈半透明、圆形、稍隆起、光滑湿润、边缘整齐。3.2API20E鉴定结果三个菌株的API20E结果均为5347124.霍乱弧菌的符合率为99.9％
3.3实验结果见表2：
讨论：
1.实时荧光PCR在霍乱弧菌检验中的优势：外环境水体和海产品中带菌量少.明显低于其他弧菌.在检测中易被掩盖和忽略，使用常规培养法、血清学检测法无法检出.这时可以考虑使用分子生物学的方法来提高检出率。实时荧光PCR(TheReal—timeFluorescencePCR)在含菌量少、菌株易发生变异(外环境疫水和海产品及霍乱越冬)标本的检测上.有独特的优越性
2.该次分离的三株霍乱弧菌.经省级疾病预防控制中心复核并鉴定.确认ZS0501菌株为O，群Elt0r霍乱弧菌稻叶型19K，ZS0502菌株为O群Eltor霍乱弧菌：bJlJ型8L.ZS0503菌株为非OE0∞群霍乱弧菌。按照《霍乱防治手册》第五版，O群Eltor霍乱弧菌稻叶型19K及O，群Elt0r霍乱弧菌小川型8L等菌株均为常见的非流行株，即在外环境、自然水体中长期存在。一般不致病或仅引起散发腹泻病例的菌株这个鉴定结果有助于口岸部门及时掌握情况.制定必要的措施。对进出境的水产品进行有效的监控。
3.据报道，O群霍乱弧菌会发生血清型的转换突变主要表现为小川型(ogawa)和稻叶型(Inaba)双向转变。以d——,JlJ型向稻叶型的转变为多见。此次所分离的菌株ZS0501、ZS0502都来源于同一外环境.但既有稻叶型又有d——,Jll型.说明了埃尔托型霍乱弧菌在外环境中是经常变异的。
4.用传统的微生物生理生化培养法来进行霍乱弧菌的检测.很容易发生漏检荧光PCR方法将DNA扩增和分子杂交同步进行.同时采用闭管检测。扩增后无须电泳。避免了常规PCR引起的假阳性污染.不仅特异性强、而且简便、快速、灵敏，可大大提高检出率。但是。由于荧光PCR既可以检活菌也可以检死菌.因此结果报告一定要结合微生物生理、生化培养法的结果。