【LorMe周刊】别有洞天——蹭行和泳动运动在青枯菌致病性中的作用
作者：于嘉宝，南京农业大学硕士在读。主要研究青枯菌多态性与动态阻控。
探究由pil-chp基因编码的菌毛途径介导了哪些过程？它们有何作用？
作者首先通过同源分析发现青枯菌中一个新的基因簇与铜绿假单胞菌第IV簇编码的PilI和ChpA同源物的基因有很强的相似性。随后，作者构建了青枯菌pilI和chpA基因敲除突变体和青枯菌蹭行(pilA)和游动(fliC)运动基因的突变体，并研究了这些基因在青枯菌运动性和植物定殖性中的作用，最终证明了青枯菌中由pil-chp基因编码的菌毛介导的途径的功能性，证明了pilI和chpA基因是真正的“运动调节器”，控制着蹭行运动及其相关的三种表型：毒力、自然转化和生物膜的形成。
同源分析表明，在pil-chp操纵子中存在单个pilI(类似CheW)和chpA(类似CheA)的同源基因。它总共包括五个pil-chp同系物：青枯菌 RSc0668 (pilG), RSc0669 (pilH), RSc0670 (pilI),RSc0671 (pilJ), 和RSc0672 (chpA)。为了确定pilI和chpA在青枯菌运动和趋化中的作用，作者替换了它们的蛋白质编码序列，从而创建了无效突变体。含有灭活的pilA、fliC或cheA基因的菌株也被设置为对照：pilA突变体蹭行障碍，fliC突变体泳动障碍，cheA突变体无趋化性。
野生型青枯菌GMI1000菌落表现为正常的蹭行表型，菌落边缘不规则，观察到多个突起。相反，pilI突变体菌落边缘无突起，与非蹭行运动控制的pilA突变体相同。chpA突变株菌落边缘的突起较小，蹭行运动减弱，不过仍有一些残留的运动痕迹。fliC鞭毛突变体对照菌株蹭行痕迹与WT GMI1000菌株相似 (图1 A)。
有研究报道，TFP基因失活可能改变鞭毛控制的运动力，反之亦然。因此，作者分析了pilI和chpA突变体的泳动能力，同样包括作为对照的pilA、fliC基因敲除体，已知这两种基因分别只在蹭行和泳动运动中受到影响。在适当的半固体培养基中生长后，pilI和chpA突变体在接种区周围表现出典型的泳动痕迹，与WT菌株相似，而fliC对照突变体完全无泳动能力。不过与WT亲本相比，pilA突变株有更多的泳动光晕（图1 B）。通过通过测量72小时的分散晕后发现，pilA突变体与其他正常泳动表型的菌株(WT、pilI和chpA突变体)之间有显著差异，并且随着时间的推移而更加显著(图1 C)。fliC对照菌株的泳动光晕明显减少。
为了确定这些运动模式是否影响细菌的趋化性，作者使用酪蛋白氨基酸作为趋化剂进行了毛细管分析。由于fliC突变体缺乏泳动运动能力，因此构建了一株cheA突变体（其趋化反应被取消），将其作为更合适的对照纳入检测中。在亲本菌株和TFP相关突变体中，观察到充满酪蛋白氨基酸的毛细管中的细菌数量高于只含有趋化缓冲液的毛细管中的细菌数量。因此，除了有活性但无趋化性的cheA基因敲除外，与WT株相比，在任何与TFP相关的基因敲除体中都没有观察到明显的趋化性差异（图1 D）。
TFP是细菌进行自然转化所必需的。因此，为了检测它们的自然转化能力，将WT菌株和相应的pilI、chpA、pliA和filC基因敲除突变体暴露在含有庆大霉素盒的DNA中，两侧是青枯菌基因组非编码区的1kb同源序列，并计算了庆大霉素抗性菌落的恢复频率。结果表明，pilI和chpA突变体的转化频率低于WT品系（图2）。正如预期的那样，缺乏TFP的pliA突变体完全不能自然摄取DNA，而filC突变体的转化效率与WT品系相当。
除了在运动中的作用外，TFP和鞭毛在生物膜形成和初始细菌吸附到植物根部中也有重要作用。作者测量了细菌突变体产生生物膜的能力。pliA对照突变体产生的生物膜对比WT菌株显著降低。与GMI1000菌株相比，chpA和filC突变体生产生物膜能力也减弱了。pilI突变体与无运动性的pliA突变体相似，也丧失了蹭行能力，与WT亲本菌株相比，其生物膜形成显著增加（图3 A）。此外，互补pilI突变体的生物膜形成能力有所恢复。
随后作者将每个细菌菌株接种在分离的番茄根培养，并量化它们附着在根表面的能力。这些实验的结果表明，所有TFP突变体(pilI、chpA和pliA)的根附着水平均低于WT GMI1000菌株 (图3 B)。此外，与WT菌株(图3 B)相比，filC突变体也表现出显著的下降。结果表明，TFP和鞭毛都促进了青枯菌与番茄根之间的粘附。
图3 WT、pilI、chpA、pilA、filC形成生物膜（A）及吸附在根上（B）的能力
为了确定pilI和chpA对青枯菌致病性的影响，在土壤中接种病原菌，模拟青枯菌的自然侵染过程，对番茄植株进行了侵染实验。四个突变体(pilI、chpA、pilA和fliC)它们的毒力显著降低（图4 A）。用同样的方法再次侵染番茄，在接种后4、8和12dpi时，从感染的番茄植株的3厘米的茎切段中统计细菌数量。与其他菌株相比，只有pilA突变体在第4天和第12天表现出显著降低，其茎组织中的细菌数量与WT菌株相似（图4 B）。结果表明，与野生型相比，任何突变体的生长都没有差异。相反，当直接使用叶柄注射感染番茄时，pilI和chpA基因敲除菌株的毒力在统计上没有显著降低(图4 C)，而pilA突变体与WT相比，在病情指数上表现出显著的差异。filC突变体的毒力也与WT株相当。随着时间的推移，除了pilA突变体，所有突变体在受感染的植物茎中测量到的细菌数量与WT菌株基本一致（图4 D）。因此，在青枯菌与番茄植株的相互作用中，TFP比鞭毛更重要。
为了研究pilI、chpA、pilA和fliC青枯菌基因敲除突变体在番茄植株上的分布，对盆栽的番茄植株接种菌株，并在3dpi和6dpi处记录不同茎段的冷光。在3dpi时，在茎的任何部位，突变菌株和WT菌株之间无显著差异（图5）。然而，在6dpi时， pilA突变体与WT菌株相比，其发光量显著降低。在6dpi时，任何其他菌株无明显差异。
图5 细菌在植物组织中的传播
在这项工作中，作者证明了青枯菌pilI、chpA、和fliC缺失突变体的毒力在植物定殖的第一阶段就受到了损害，而pilA突变体在浇水或叶柄接种后生长减慢。这是关于青枯菌IV型菌毛调节剂pilI和chpA的首次报道，作者首次证明了青枯菌中由pil-chp基因编码的菌毛介导的途径的功能性，证明了pilI和chpA基因是真正的运动调节器，控制着蹭行运动及其相关的三种表型：毒力、自然转化和生物膜的形成。此外，本文还首次描述了缺乏pilA的GMI1000菌株的高运动性泳动表型以及fliC在根附着和生物膜形成中的作用。在文章的最后，作者建议对青枯菌进行更深入的研究，以探明蹭行和泳动运动之间可能存在的联系。
论文信息
原名：Twitching and Swimming Motility Play a Role in Ralstonia solanacearum Pathogenicity
译名：别有洞天——蹭行和泳动运动在青枯菌致病性中的作用
期刊：mSphere
IF2020：5.90
发表时间：2020年3月
通讯作者：Marc Valls
通讯作者单位：西班牙巴塞罗那农业基因组学研究中心