一作解读|268份国内外普通小麦品种叶锈和条锈抗性鉴定及全基因组关联分析
2021年1月25日，河北农业大学植物保护学院小麦叶锈团队在Theor Appl Genet在线发表了“Genome wide association mapping of leaf rust and stripe rust resistance in wheat accessions using the 90K SNP array”的研究文章。该研究对268份国内外小麦材料进行了抗叶锈和条锈鉴定及全基因组关联分析，挖掘了多个与锈病相关的抗性位点及兼抗叶锈和条锈位点，为小麦锈病抗性育种奠定了理论基础。
小麦叶锈病是由小麦叶锈菌（Puccinia triticina）引起的重要真菌病害，在全世界范围内任何小麦种植区均能够发生，是造成全球小麦减产的主要原因之一。虽然叶锈病的危害程度没有小麦秆锈病或条锈病严重，但由于其发生广泛，从全球小麦产量损失来看，叶锈病每年导致的产量损失比条锈病和秆锈病更严重。在我国，小麦叶锈病在过去主要发生在长江流域、西南麦区、华北和东北部分麦区，近年来随着全球气候变暖，小麦叶锈病在全国主要麦区有加重的趋势（Zhou等，2013）。
小麦条锈病是由小麦条锈菌（P. striiformis f. sp. tritici）引起，其一直是威胁我国小麦安全生产的重要病害，在流行年份，小麦条锈病可造成小麦减产20%-30%，严重的高达50%以上，甚至绝产（李振岐和曾士迈，2002）。
本研究选择了268份来自国内外普通小麦品种（其中207份小麦品种来自我国小麦主产区，61份普通小麦材料来自于10个国外国家），在苗期选择了8个不同毒力的叶锈菌生理小种进行抗性鉴定，成株期进行了多年多点的抗叶锈及条锈评价。同时利用90KSNP芯片结合全基因组关联分析技术定位与锈病抗性相关抗性位点。本研究旨在明确供试小麦材料的抗性特点，挖掘抗锈相关位点及其连锁的分子标记，为基因的下一步克隆及抗病基因的利用奠定基础。主要研究内容如下：
1、 苗期抗叶锈及成株期抗叶锈及条锈表型鉴定
苗期抗叶锈鉴定结果表明268份小麦材料对8个不同的叶锈菌生理小种表现出差异抗性，其中22个小麦品种对8个供试菌种均表现抗病，112个小麦品种表现感病。在成株期分别于2014/2015、2015/2016、2016/2017年度在河北保定和河南周口进行了叶锈严重度的调查，此外，为了挖掘兼抗叶锈和条锈的位点，供试品种于2015/2016、2016/2017、2017/2018年度在四川成都进行了条锈抗性鉴定。供试品种的叶锈BLUPs从3.1-84.6%均有分布，条锈BLUPs值分布范围为4.5-84.0%，40个小麦品种抗性优良，成株期叶锈和条锈MDS（最大严重度）均小于10%。叶锈及条锈MDS在不同环境下呈现极显著相关，相关系数分布为0.59-0.82和0.54-0.69。其中叶锈和条锈MDS间的相关系数为0.29-0.46，说明可能存在兼抗位点。
2、 群体结构及亲缘关系分析
群体结构分析结果显示268份小麦材料可以划分为2个亚群（图1）。亚群1中包含了142个品种，这些品种大部分来自河南、安徽、江苏和陕西等省份，另外126份材料位于亚群II，大部分来自于北京，山东和国外品种。亲缘系数分析结果显示，亲缘关系为0的品种占57.2%，亲缘系数介于0-0.1、0.1-0.3、0.3-0.5和0.5-0.7间的品种分别占0.19、0.17、0.04和0.01，亲缘系数大于0.7的占0.01。
Fig. 1 Population structure and kinship among 268 wheat accessions based on unlinked SNP markers. (a) Plot of delta K against putative K ranging from 1 to 10; (b) stacked bar plots of ancestry relationship of accessions; (c) Heat map of kinship matrix using the IBS method
苗期利用8个叶锈菌生理小种进行叶锈抗性GWAS结果显示，总共关联到21个抗叶锈位点，包含已知抗叶锈病基因Lr1、Lr26、Lr3ka和LrZH22等，分别解释了4.6-25.2%的表型变异。其中，位于2BS染色体上的LrZH22在6个供试叶锈菌生理小种GWAS结果中检测到，贡献率为5.4-12.1%。Lr-3BS、Lr1和Lr3ka也能够在6个不同的叶锈菌生理小种检测到。5个生理小种GWAS结果检测到Lr-7BL.2。对于FGRQ，检测到位于同一LD block的376个SNP位点与Lr26相关联。
在成株期关联到22个抗叶锈位点，23个抗条锈位点，其中在多个环境及BLUP中检测到的稳定的抗叶锈位点7个，分别位于1BL、2AL.1、2BS、3BS、4AL、6BL和7BS染色体上。稳定抗条锈位点6个，分别位于1BL.2、1DS、2AL.1、2AL.2、6BS和7BL.1染色体。其中LrZH22在苗期和成株期均表现出优良抗性。
GWAS检测到4个兼抗叶锈和条锈的位点，其中包含位于1BL上的已知基因Lr46/Yr19。此外，位于2AL染色体上的QLr-2AL.1/QYr-2AL.1也表现出稳定的兼抗性，该抗性位点在供试材料中频率较高（占73.5%）。其余2个兼抗位点仅在较少的环境中检测到，效应较小。本来GWAS预测可能关联到的有效抗病基因Lr34/Yr18及Lr37/Yr17在本研究中却没有关联到，利用与基因紧密连锁的分子标记检测供试品种，结果显示26个品种含Lr34/Yr18，18个品种含Lr37/Yr17，T检验结果显示，这两个基因在供试材料中表现出优良的叶锈及条锈抗性。GWAS检测不到这两个基因可能由于90K芯片SNP标记在染色体上分布不均，或供试品种中基因频率低造成。这就凸显出GWAS可能存在的劣势，群体中频率较低的抗性基因可能检测不到，然而这些基因很可能为潜在的重要基因。
Fig. 2 Manhattan plots for infection types of leaf rust at seedling stage (a) and Best linear unbiased prediction (BLUP) of leaf and stripe rust MDS across all environments at adult plant stage (b) using the mixed linear model (MLM). The horizontal line shows the genome-wide significance threshold -log10 (P value) of 3.0.
4、 有利等位基因的位点的效应及显著关联SNP的效应
为进一步了解等位基因位点个数与叶锈和条锈MDS的关系，我们计算了每个品种中含有的与稳定抗性相关的有利等位基因位点个数。以有利等位位点个数为横坐标，纵坐标为叶锈和条锈BLUP值的均值，绘制了散点图，并拟合了一条曲线，估算了线性回归方程（r2=0.94和0.77），结果显示不同抗性位点间，加性效应明显，有利等位位点越多，严重度越低（图3）。其中，3个品种，济南13、Aca 801和Mason/Jagger有7个叶锈有利基因位点，其严重度均值为7.2%。22个品种含有9个条锈有利基因位点，其严重度均值为13.7%。
Fig. 3 Linear regression between numbers of favorable alleles and MDS BLUP values from multiple field environments: (a) leaf rust and (b) stripe rust
5、 双亲遗传群体的验证及KASP标记的转化
前期本课题组做了大量的抗叶锈QTL定位的工作，其中，利用90K SNP芯片对周8425B/中国春RIL群体进行抗叶锈QTL定位，结果显示GWAS关联的区间与周8425B/中国春RIL群体中与QLr.hebau-2BS（LrZH22）位置一致，这说明GWAS定位到的位点为LrZH22。此外，QLr.hebau-3BS与GWAS定位的QLr-3BS的区间一致，可能也为相同位点（Zhang等 2017）。
进一步根据关联到的显著SNP，从网站上下载了90K SNP芯片KASP标记序列信息（http://www.polymarker .info/designed_primers），我们合成了90对与抗锈位点显著关联的KASP标记，利用KASP标记对来自7个遗传群体的20个高抗叶锈家系（HR，MDS<5%）和20个高感叶锈家系（HS，MDS>60%）进行验证。其中12对KASP标记在群体中成功分型，2对与LrZH22紧密连锁的KASP标记在周麦22/中国春HR和HS家系中差异显著。与Lr46连锁的SNP位点在百农64/京双16和Fundulea 900/Thatcher群体也表现出明显的差异。另外9个标记也成功转化为KASP标记，但T检验结果显示在所有群体中的HR和HS家系中的MDS没有显著的差异，说明这些位点在供试群体中可能效应较小。这些标记可以用于后续的分子标记辅助选择育种。
致谢
河北农业大学植物保护学院张培培讲师和闫晓翠博士为该论文共同第一作者，李在峰教授和刘大群教授为共同通讯作者。感谢四川农科院杨恩年研究在成株条锈病鉴定所做的工作，感谢中国农业科学院夏先春研究员和何中虎研究员提供的基因型数据及在论文撰写过程中给予的宝贵意见。该研究得到“十三五”国家重点研发计划（2017YFD0300906-07），河北农业大学引进人才专项基金（YJ2020010），河北省青年基金（C2020204167），国家自然科学基金（31361140367）的资助。多年来本课题组一直从事小麦叶锈病抗性鉴定及抗病遗传等相关研究工作，目前我们正在对一些基因进行精细定位和克隆工作，期待与国内其他单位开展合作。最后感谢小麦研究联盟提供的良好的交流平台，祝小麦研究联盟越办越好！
参考文献：
Zhou HX, Xia XC, He ZH, Li X, Wang CF, Li ZF, Liu DQ. Molecular mapping of leaf rust resistance gene LrNJ97 in Chinese wheat line Neijiang 977671. Theor Appl Genet, 2013, 126:2141–2147
李振岐，曾士迈. 中国小麦锈病，北京：中国农业出版社，2002
Zhang PP, Yin GH, Zhou Y, Qi AY, Gao FM, Xia XC, He ZH, Li ZF, Liu DQ. QTL mapping of adult-plant resistance to leaf rust in the wheat cross Zhou 8425B/Chinese spring using high-density SNP markers. Front Plant Sci, 2-17, 8:793