人们对于毒品的神经生理学依赖原理还不了解，基于伦理道德的限制我们无法进行针对人的研究，利用大鼠可以克服这种阻碍，可以较为直观地观察毒品对其造成生理学依赖的神经生理学原因。鸦片类药物的使用障碍与海洛因戒断期间持续的消极情绪类似，这种情绪会驱使出现戒断症状的患者做出强迫性吸食和主动寻求药物刺激的行为。针对大鼠的功能核磁成像（fMRI）可以识别出海洛因戒断期间产生神经系统刺激激活的神经回路。使用任务态的分析方法，比较在吸食海洛因时与戒断反应之间的大脑激活差异。我们发现下丘脑与杏仁核的激活与对海洛因的依赖程度相关。这或许与吸食者主动寻求并吸食毒品的消极情绪相关。本研究或为吸食毒品造成的神经依赖提供了新的神经生物学见解。本文发表在Journal of Clinical Investigation当前美国正经历毒品肆虐的危机。我们需要新的视角来认识鸦片类药物的作用机理，以便有效地控制鸦片类药物滥用（Opioid Use Disorder，OUD）并减少由于过量用药致死的情况。我们认为吸毒者通过吸食鸦片类药物来缓解或者消除戒断反应中如焦躁、疼痛以及抑郁引发的负面情绪。而在临床和临床前的研究模型中，这些消极的环境刺激都会诱导患者自发地吸食鸦片类药物。患者在遇到与鸦片类药物相关的刺激时常会引发戒断反应并唤醒对毒品的诉求。
而以鸦片类药物为条件诱发的刺激可能会通过产生消极的情绪驱使患者去寻求毒品从而延续和恢复对鸦片类药物的依赖，而消极的情绪也会通过吸食鸦片类药物而得到缓解。识别这种支持了戒断条件诱发的神经活动，或许可为OUD患者这种较差的、长期的神经可塑性的治疗效果提供一种新的认识视角。因此本文假设有负责负面情绪处理的大脑回路会参与到长期持续的戒断反应。基于大鼠药物依赖的研究分析，我们发现大脑情绪系统在毒品诱发的这种戒断反应确实会有参与。
被试信息：实验选择了21只成年的雄性Long-Evans大鼠。每两到三只放一笼饲养，光照上每天12小时光照12小时黑暗处理，饲养到6周时插入筋脉导管，体重控制在250~275g，扫描时在静脉输入异氟烷进行麻醉。大约3到3.5个月时开始接受扫描。饲养时按照标准供给食物和水，实验主要在黑暗中进行，只有少数较长的实验会延续到白天。用药：海洛因盐酸盐，溶解于0.9%的无菌生理盐水(60磅/公斤/0.1 ml)进行静脉输液。盐酸纳洛酮溶解于0.9%的无菌生理盐水中，用于注射，注射量为1ml /kg和120°g/kg。实验设计：为验证我们的假设，我们设计了一个行为模式实验，实验中诱发的刺激会与其引发的消极情绪相对应。首先我们对大鼠进行了分组，一组为长时接触组（LgA，n=10）每天12小时，一组为短时接触组（ShA,n=11），每天接触1小时，按照60微克每公斤的剂量训练其自行取食海洛因，以此模拟非依赖性和依赖性吸食海洛因的情况。LgA组大鼠的取药量会有快速的增加，而ShA大鼠的取药量则保持稳定。在诱发条件控制上，大鼠会在用药时注射30分钟的生理盐水或者纳洛酮以形成条件反射。在一定的剂量内，在鸦片依赖大鼠体内纳洛酮会与海洛因在鸦片受体上进行竞争，从而诱发戒断相关的症状，但是不产生生理性的戒断反应。在给药处理上还会引入以柠檬和香草的气味作为气味诱发的条件刺激。这种搭配的刺激持续30分钟，以配合纳络酮的作用时间。在气味诱导的训练后，ShA（短时接触组）大鼠被放回笼子里，而LgA（长时接触组）大鼠则在没有气味诱导的情况下完成12小时的训练。
Figure 1实验设计流程
统计：使用双因素方差分析对海洛因自我给药的大脑激活进行统计分析，海洛因获取(ShA和LgA)作为被试之间的分组因素，session或cue(生理盐水和纳洛酮耦合刺激)作为被试内部的因素。差异的显著性水平控制在0.05。事后比较使用Bonferroni 方法对P值进行多重比较校正。行为实验的统计分析采用GraphPad Prism 7软件进行。其中1只LgA大鼠因导管通畅失败被排除在研究之外。对于fMRI数据分析，通过多元回归分析去除了白质和脑脊液的平均信号。 我们进行了全脑2（海洛因接触方式，ShA与LgA的接触）×2（盐水与纳洛酮配对的气味）×2（呈现顺序第1和第2块与第3和第4块）的混合设计ANOVA的比较，使用扫描期间的平均呼吸频率作为协变量。利用AFNI中的3dClustSim方法估计假阳性团块的概率，用估计得到的阈值限制体素级别显著性，限制团块大小阈值，用于校正多重比较。经过校正的团块大小为13，p<0.01。我们使用皮尔逊相关分析来检验以纳洛酮作用期间海洛因的注射量为标准的行为指标和血氧信号的相关性，该信号由19个ROI中对气味刺激的响应有显著激活区域中提取。采用FDR校正对P值进行多重比较矫正，显著性水平设置为 0.05。
Figure 2 戒断条件下负面情绪学习的大脑回路；A，随着实验进行两组大鼠海洛因取食量的变化，可以看到LgA大鼠的注射量相对于ShA大鼠明显的升高，B，不同纳洛酮浓度诱导下，两组大鼠海洛因注射量的变化比较，在纳洛酮注射时，两组大鼠的注射量是有显著差异的，同时在纳洛酮处理核分组之间存在交互作用，结果发现在所有的组间，相对于盐水诱导，纳洛酮诱导的大鼠海洛因吸食量有了明显的提高。而所有的组别对于气味的条件刺激下海洛因的吸食量无明显的增加。由于纳洛酮相对于海洛因与鸦片类受体的亲和力更强，使得其在LgA大鼠中产生了更强的戒断反应。通过消除纳洛酮和海洛因的控制而可缓解这种戒断作用。对于纳洛酮诱导组海洛因吸食量的增加或许可以解释为纳洛酮对奖赏系统造成了一定的损伤，同时随着被试用药量的逐渐增加也导致了其耐药性的增强。早期的研究表明，在LgA大鼠中，配合纳洛酮治疗的复合听觉和视觉刺激增加了颅内自我刺激阈值，并在海洛因自我给药过程中激发了被试继续摄入海洛因的动机，这表明该刺激对纳洛酮诱发的戒断形成了条件反射。在这里，我们证实先前与纳洛酮复合的嗅觉线索在LgA大鼠中同样引起了海洛因摄入量的增加，但这种情况在ShA大鼠中并未出现。此外，与盐水复合的气味线索相比，在LgA大鼠中呈现的与纳洛酮搭配的嗅觉条件刺激在海洛因快感消失后，激发了对海洛因更大的需求。为了探索条件反射性戒断背后的大脑回路，我们在功能磁共振成像(fMRI)采集小鼠最后一次提示条件反射自我给药24小时后，将嗅觉线索单独呈现给轻度麻醉的自发海洛因戒断大鼠。实验中我们可以使用轻度麻醉方法对大鼠进行处理，保证大鼠的神经血液耦合以及对气味的感知和处理能力。在连续扫描过程中，气味刺激的呈现使用block设计，同时其呼吸率也会随着提示的呈现而波动。我们以响应相对于基线的变化为主要分析变量，呼吸率为协变量，构建刺激呈现方式×海洛因接触方式×分块的2×2×2的混合方差分析模型，来查看各个条件的交互作用。在将大鼠大脑对齐到标准空间后，按照解剖学定义将其划分为19个ROI构建大鼠的脑图谱。随后我们以处理期间海洛因注射的次数来衡量大鼠海洛因的依赖程度，并评估每个脑区的激活强弱与依赖程度之间的关系。在经过多重比较矫正之后，我们确定了下丘脑簇、下丘脑核以及杏仁核内测，杏仁核中央核及延伸杏仁核等脑区与海洛因依赖有较为明显的相关关系。在这些脑区中，LgA大鼠里由于纳洛酮复合诱发的脑血流信号出现了增加，而ShA大鼠则是减弱的。纳洛酮复合条件处理期间海洛因的摄入与下丘脑簇和杏仁核对纳洛酮复合诱发的脑血流响应存在相关性。条件反射中，戒断反应越强烈这些相关区域的激活也越强。
Figure 3不同脑区相对于基线血氧信号变化率的展示
在鸦片依赖的大鼠中，鸦片的戒断反应会激活延伸杏仁核在内的情绪感知系统，基于人类的研究发现鸦片依赖会改变杏仁核的连接模式。在鸦片类药物依赖的人类和大鼠中都有发现随着药物的停用引发下丘脑-垂体核-肾上腺HPA轴的激活。在鸦片类药物戒断过程中下丘脑室旁核的激活以及随后的HPA轴的驱动可能是与鸦片类药物过量摄入相关的一种早期失调。我们假设HPA轴的失调和延伸杏仁核的敏感性通过糖皮质激素信号传导维持负面的情绪状态。 这些结果表明：以前中性的刺激与鸦片类药物戒断相结合时，首先会产生激素压力样反应，从而激活延伸杏仁核的下丘脑外脑应激系统，形成消极情绪状态的途径，最后驱动人类中的渴望和复吸。
同时还有一些其他区域也表现出与下丘脑和杏仁核类似的激活情况。而这些区域中有许多与情绪学习有关，并被假设在成瘾过程中会处于失调状态。这些脑区包括外侧下丘脑、丘脑背侧核、腹外侧丘脑和背侧纹状体。在OUD患者中，这些区域和杏仁核一同被海洛因的条件刺激激活。延伸的杏仁核通过与侧下丘脑等区域的下部连接，促进了消极和积极情绪的形成。同时作为习惯学习回路的一部分，丘脑和腹侧纹状体与奖赏以及动机性的突显刺激有明显的关系。此外，在LgA大鼠中纳洛酮复合刺激激活了连合前核(PRC)、导水管周围灰质(PAG)、心室周围灰质(PVG)和皮层前核，而在ShA大鼠中，这些区域并未激活。盐水复合刺激下对LgA大鼠的对应脑区是未激活的，在解剖学上PRC和PAG/PVG与延申杏仁核、下丘脑和前额核相连，其在负面情绪的学习中起到关键作用。最后，气味符合刺激下激活了LgA大鼠下丘脑前部与缰核一致的区域，而在ShA大鼠中则是相反的。缰核能够抑制中脑边缘的多巴胺释放，以调节情绪和动机的形成。缰核与下丘脑和杏仁核一同起着维持体内积极情绪的作用。虽然由于功能磁共振成像的空间分辨率和大鼠缰核过小的尺寸限制了我们确认其激活的可能性，但在负面的条件反应中缰核的潜在参与还值得进一步研究。
Figure 4在条件反射期间的戒断严重程度与下丘脑和杏仁核中响应纳洛酮配对提示的大胆信号的变化相关。(A)从图1C所示的大胆信号线索海洛因通路交互作用中提取下丘脑团块。(B)注射盐水条件下，下丘脑群中从基线到仅提示信号的粗信号变化的平均百分比。点图显示每个条件的单独数据。(C)两组海洛因获取组在纳洛酮条件作用期间海洛因摄入和下丘脑团块对纳洛酮配对提示的信号反应的散点图(Pearson s相关性)。(D)杏仁核从图1C中显示的大胆信号线索海洛因进入交互作用中提取，我们发现，条件性的海洛因激活会激发海洛因的摄入并影响以下丘脑应激性回路为主的参与负面情绪学习相关的大脑区域。这些回路与患有药物提示反应性任务的OUD患者的fMRI结果一致并扩展了其发现。因此，我们认为，条件刺激线索可以通过消除厌恶状态和产生积极激励状态来维持强迫性用药，而且这两种学习形式都有助于情绪过程中的非稳态变化，从而使患者将用药习惯持续下去。暴露在条件性戒断刺激下，可能会通过诱导一种强烈的厌恶压力状态来驱动OUD患者的对药物的渴望，而这种状态可以通过鸦片类药物的使用来缓解。条件性退缩触发的刺激可能与传达学习的耐受性的刺激相同。因此，OUD患者在比如治疗设施中进行了排毒或从监禁中释放后，在不熟悉的情况下或未以明确的提示使用鸦片类药物并且其身体无法利用习得的补偿机制或遇到条件性戒断刺激时，特别容易因用药过量而死亡。关键的是，美国食品和药物管理局批准的3种针对鸦片受体用于OUD患者的药物或不能完全缓解诱导条件下的戒断。总而言之，本实验为了解和针对条件性戒断和下游情绪背后的脑回路提供一种新颖的概念框架，可创新性地用于预防鸦片类药物使用过量及其导致的死亡。同时通过fMRI检查对药物相关线索的心理反应提供了一个潜在的强有力的方法来理解导致和维持强迫性阿片类药物使用的个体差异的原因。事实上，负面情绪学习大脑回路的功能障碍是追踪OUD进展和缓解的一个潜在的生物标记。未来的研究需要在人类OUD患者脑中对这一回路做更多的了解。
Heroin addiction engages negative emotional learning brain circuits in rats
