通常，外泌体/细胞外囊泡（EV）RNA/miRNA的分析涉及复杂的EV分离、核酸提取、PCR或者RNA-seq或者印记法等。今天我们为大家介绍一种利用分子信标 (molecular beacons, MBs)结合纳米流式的EV-RNA快速检测方法，该方法无需耗时的提取、复杂的dd/q-RT-PCR、昂贵的组学分析。
近些年的研究发现细胞外囊泡 (EV) 是细胞间生物信息的“传送器”，已成为旁分泌信号传导的新范式。EV及其货物已被证明可以调节基因表达并改变各种细胞类型的细胞功能。EV组分（RNA、蛋白质、脂质、代谢物等）的分离和分子分析对于理解EV的生物发生及其作为生物标志物的潜在效用至关重要。由于当前可用的EV分析测定的局限性，目前对单个EV的外部蛋白质和内部RNA成分进行同时多参数表征具有挑战性。这些需要大量EV一起进行分析，因此限制了低丰度EV成分的检测和EV-DNA/RNA/蛋白质的检测，并且涉及耗时（RNA-seq、dd/q-RT-PCR、south/northern/western印迹），以及昂贵的（-omics）分析。
使用EV RNA货物作为组织来源或疾病标记的指标依赖于从分离的EV中识别和量化各种RNA种类的表达水平。在分析EV中RNA的低拷贝数时，很容易低估稀有信号，其中可能包含有关宿主初始过程的关键信息，因为获得的信息代表了平均值，并未考虑EV异质性。
分子信标 (molecular beacons, MBs) 是发夹形寡核苷酸，包含与特定RNA或ssDNA分子的互补序列、荧光染料和猝灭剂。MBs与靶标结合后，会发生构象变化，将猝灭剂与荧光染料分开，从而使探针在激发时发出荧光。DNA/RNA靶标与MBs之间的结合是高度特异性的，即使是序列上任何地方的一对错配也会阻止茎的打开，从而使MB不发荧光。大多数细胞外和细胞内RNA种类都与各种RNA结合蛋白结合，这种相互作用可能会干扰基于MB的检测方法。由于寡核苷酸探针与其靶标的结合亲和力至少比RNA结合蛋白与其靶标的结合亲和力高一个数量级，因此MB能够通过置换结合蛋白成功地与活细胞中的mRNA结合。细胞穿透肽 (CPP) 是短肽序列，富含赖氨酸或精氨酸，能够通过被动或主动过程穿过生物膜。基于它们的总电荷，CPPs包含三个不同的类别：阳离子、两亲性和疏水性，每一种都使用不同的膜融合和内化机制，尽管精确的分子机制仍然知之甚少。由于CPP可以与多种生物化合物偶联，因此它们代表了一种极具吸引力的传递载体，非常适合弥合特定RNA检测、成像和流动友好型读数以及使用简单之间的差距。与MBs偶联的CPP以前已成功用于跟踪活细胞中的mRNA。
哈佛大学的这篇报道描述了一种用于检测循环EV的RNA含量的新方法，该方法结合了MB的灵敏性与特异性和纳米流式细胞术 (nFC) 的高通量以提供特定RNA信息，用于检测EV亚型中的特定RNA分子。结果表明，用MB与CPP结合检测细胞和EV可提供快速可靠的结果，这与更复杂、更耗时的RNA检测方法（如q-RT-PCR）完全一致。该方法特异性高、不受EV异质性影响。
上图：用膜染料（Cell Mask，绿色）和CPP-MB-miR451a-Alexa594（红色）标记的RBC，标准荧光显微镜（FL，上左）和超高分辨率显微镜（SRRF，上右）成像。箭头显示源自位于质膜附近的EV样膜结构的MB信号。下图左：通过高分辨率暗场显微镜检测总EV。下图右：通过荧光显微镜检测EV miR451a 特异性信号。
用非穿透性MB-miR451a (C) 或膜穿透性CPP-MB-miR451a检测的血浆EVs的纳米流式结果显示30%的阳性EVs(D)。总结一下，分子信标（MBs）检测EV-RNA的方法使用简单、特异性高、使用标准的荧光染料。但是上面使用的nano-flow并不是最佳高通量检测仪器，比如有检测限制、EV聚集成群通过、有背景信号、需要标准化等。
CytoFLEX对MBs标记的RBC-EV的检测结果
从上图的结果可以看出miR451在large EVs中的丰度（61.5%）与small EVs中的丰度（3.24%）有很大差别。CytoFLEX SRT流式分选仪，具有CytoFLEX卓越的光学系统、全自动化的操作、紧凑的设计；继承了CytoFLEX小巧，智能的优越特性，同时拥有卓越的性能与简单的操作，使得分选更加轻松与准确，不需要人为调试也能做到颗粒分辨率，让科研工作者更加专注于科学研究本身。紫色-蓝色-黄绿色-红色（V-B-Y-R）系列最高配置仪器具有15个荧光检测器。CytoFLEX SRT分选仪支持复杂的分选逻辑，可对4路液流使用不同的分选设置组合，包括捕捉其他液流中被丢弃细胞的能力。
参考文献：
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