NATURE|肺癌T细胞抗原受体（TCR）库的异质性
背景：
体细胞突变和免疫编辑共同推动了非小细胞肺癌（NSCLC）的广泛异质性。在本文章中探索了T细胞抗原受体（TCR）库的异质性。在肿瘤中选择性扩增的TCR序列的数目在肿瘤内部和瘤体之间变化，与非同义突变的数目相关。扩展的TCR可以细分为在所有肿瘤区域中发现的TCR（普遍存在的）和在区域子集中存在的TCR。普遍存在的TCR和区域性TCR的数量分别与普遍存在的和区域非同义突变的数量相关。扩增的TCR形成相似序列的TCR簇的一部分，提示空间受限的抗原驱动过程。携带无处不在的TCR的CD8 肿瘤浸润淋巴细胞表现出功能失调的组织表型。与常规随访相比，在肿瘤切除时优先在血液中可检测到普遍存在的TCR。这些研究结果提示我们使用这种非侵入性的方法，可以识别和跟踪相关的肿瘤反应性TCR，有希望用于过继性T细胞免疫疗法。
尽管大多数靶向肿瘤抗原仍是未知的，但TCR库提供了一种评估T细胞免疫反应广度和强度的方法。因此，我们着手研究NSCLC肿瘤内TCR组成，记录肿瘤中单个TCR的空间异质性，并研究异质性与基因组异质性的关系。
研究结果：
研究入组了72例肺癌患者，在手术时收集220个肿瘤区域，64个匹配的非肿瘤肺组织样本和56个外周血单核细胞（PBMC）样本，进行TCR区域测序和全外显子测序及数据分析。
a.患者选择，突变负担和临床特征。
b.显示了TCR测序队列的非同义突变的总数（克隆和亚克隆）和患者的临床特征（组织学，分期，吸烟状况和临床结果）。
1.与正常组织相比，在非小细胞肺癌中扩增的TCR，肿瘤中差异表达与肿瘤突变负担相关
图1
d：肿瘤内TCR总库的比例（TCR总数，每位患者合并肿瘤区域）由扩展的（频率≥2 / 1,000）α链和β链TCR占。最小值和最大值由箱形图的极点表示；中线由粗水平线表示；第一个和第三个四分位数用框边表示。α-链和β-链序列的比例没有显着差异。
e：火山图显示了从肿瘤和非肿瘤肺中两个均值相等的种群中采样到的TCR的可能性（–log10（P值）），针对肿瘤与非肿瘤肺中的差异表达进行了绘制。如果对数似然性> 120，则出于绘图目的将其值设为120。蓝色圆圈代表在非肿瘤肺中扩增的α-链序列（> 0.002）（59位患者的n = 3,197个TCR），红色圆圈代表在肿瘤中扩增的α-链序列（n = 59位患者的2,193个TCR）；垂直虚线表示组织之间表达的两倍差异。
f：特定于其各自组织的扩展的肿瘤或非肿瘤肺α链序列的比例，最小值和最大值由箱形图的极点表示；中线由粗水平线表示；第一个和第三个四分位数用框边表示。两者的比例显着不同，显示了两边的Mann-Whitney检验P值。
g：每位患者的非同义突变数与独特的肿瘤内扩展α链序列（频率≥2 / 1,000）之间的相关性。显示了Spearman等级相关系数和P值（n = 59位患者）。
h：非同义突变数与独特的瘤内（红色圆圈）或非肿瘤肺（蓝色圆圈）扩展的α-之间的关系的斯皮尔曼等级相关系数和P值（显示在每个点上方；n = 59位患者）链序列处于不同的频率（范围从所有TCR（阈值零）到频率≥8/ 1,000的序列）。β链序列的等效图显示在扩展数据图3f中。n例59例患者）在不同频率（从所有TCR（阈值零）开始）的非同义突变数量与独特的瘤内（红色圆圈）或非肿瘤肺（蓝色圆圈）扩展的α链序列之间的关系。频率≥8 / 1,000的那些）。β链序列的等效图显示在扩展数据图3f中。n例59例患者）在不同频率（从所有TCR（阈值零）开始）的非同义突变数量与独特的瘤内（红色圆圈）或非肿瘤肺（蓝色圆圈）扩展的α链序列之间的关系。频率≥8 / 1,000的那些）。
2.非小细胞肺癌中扩增的TCR包含普遍存在的TCR和区域性TCR，它们的表达分布情况与肿瘤的突变谱相关联
图2
a：热图显示了不同范围内的扩展肿瘤内α链序列（频率≥2 / 1,000）的丰度（每个TCR被发现的次数的log2）几个病人的肿瘤区域。患者ID显示在每个热图的上方。每一行代表一个唯一的序列，每一列代表一个肿瘤区域。
b：对来自患者肿瘤的多个区域的TCR库进行测序，并通过使用相似度对来自同一肿瘤的不同区域的库进行成对比较。成对的肿瘤内TCR谱表相似性显示了每个患者的情况。每个圆圈代表来自同一患者肿瘤的两个区域之间的比较（n =来自49位患者的226个总比较）。对于所有箱形图，最小值和最大值由箱形图的极点指示。中线由粗水平线表示；第一个和第三个四分位数用框边表示。通过降低平均肿瘤内TCR相似性沿x轴对患者进行排序。
c：针对每个患者，针对基因组多样性绘制了TCR库（α链序列）多样性。多样性测量值计算为归一化的Shannon熵。显示了斯皮尔曼等级相关系数和P值；n = 38例患者。β链序列的等效图显示在扩展数据图4c中。
d：每个肿瘤区域普遍存在的和区域性非同义突变的数量。最小值和最大值由箱形图的极点表示；中线由粗水平线表示；第一个和第三个四分位数用框边表示。无处不在的突变数大于区域突变的数，显示了双面Mann-Whitney检验P值；n = 60例患者。
e：每个肿瘤区域扩展的（频率≥2 / 1,000）泛在（红色圆圈）和区域（灰色圆圈）α链序列的数量。最小值和最大值由箱形图的极点表示；中线由粗水平线表示；第一个和第三个四分位数用框边表示。无处不在的TCR的数量大于区域TCR的数量，并显示了两边的Mann-Whitney检验P值；n = 49位患者。
f：肿瘤内扩张的α-链无处不在的频率分布（红色圆圈；n = 1,379个来自49位患者的单个TCR）和区域性（灰色圆圈；n =来自44位患者的446个单独的TCR）。最小值和最大值由箱形图的极点表示；中线由粗水平线表示；第一个和第三个四分位数用框边表示。与双面曼恩·惠特尼检验（P = 2.7×10–⁶）相比，扩展的区域TCR的表达量比普遍存在的TCR更高。
g; 针对每个肿瘤区域的普遍（左）或区域（右）非同义突变数绘制扩展的普遍（顶部）或区域（底部）α链序列数。显示了Spearman的等级相关性和相关的P值；虚线对应于中值。n = 39位患者。
h: 根据扩大的肿瘤内普遍存在的α-链序列的数目（顶部）或扩大的肿瘤内区域α-链序列的数目（底部）对患者进行分层。n = 39位患者。红线表示高于中位数的比率，蓝线表示低于中位数的比率。显示了Kaplan–Meier P值。
3.肿瘤内扩增的TCR CDR3序列可识别相关TCR的簇，并显示出增强的融合重组
图3
α: 该图说明了CDR3相似性网络的构建过程。单个CDR3被解构为连续氨基酸三联体的重叠系列，并且两个CDR3之间的成对相似性被计算为归一化字符串（三联体）核。成对相似性> 0.82的CDR3通过边缘连接。
b: 患者CRUK0009的肿瘤内CDR3β链序列的代表性网络图。两幅图均显示了与肿瘤内至少一个其他TCR连接的TCR CDR3β链序列网络。左图，围绕扩大的肿瘤内普遍存在的TCR（红色圆圈）聚集。星号表示在c中分析了其CDR3序列的簇。对，聚集来自相同库中的随机TCR样本（与扩展的无处不在的TCR的数目相同）。
c: 来自单个簇的CDR3序列比对的代表性实例。
d: 对所有患者都运行了聚类算法，并显示了包含扩展的无处不在的和控制的随机选择的β链序列的网络的簇数。最小值和最大值由箱形图的极点表示；中线由粗水平线表示；第一个和第三个四分位数用框边表示。扩展的TCR表现出更大的聚类性，显示了单侧Mann-Whitney检验P值；n = 46位患者。
e: 来自CRUK0009的无处不在或区域扩展的TCR周围的代表性簇，其节点根据发现每个TCR的区域着色。
f: 包含无处不在或区域性扩展TCR的集群的平均集群Shannon多样性（请参阅“方法”）。显示了单侧Mann-Whitney检验P值；n = 42例患者。最小值和最大值由箱形图的极点表示；中线由粗水平线表示；第一个和第三个四分位数用框边表示。
g: 收敛重组的量被计算为对每个扩增的泛在TCR的每个观察到的TCR CDR3氨基酸序列有贡献的不同DNA TCR序列的平均数，与每个患者肿瘤内库中随机选择的一组TCR（左）或区域TCR（右）相比。显示了单侧Mann-Whitney P值；n = 43位患者。最小值和最大值由箱形图的极点表示；中线由粗水平线表示；第一个和第三个四分位数用框边表示。该图中所有小图均指TCRβ-链序列，因为它们显示出更多的多样性和更低的聚类背景速率。
4.肿瘤内扩增的TCR中普遍存在的TCR与肿瘤中的TH1和CD8 T细胞转录特征有关，并具有与肿瘤抗原反应性一致的表型
图4
a: 扩大的肿瘤内泛在和区域α链TCR序列数与转录表达得分之间的相关性各种免疫相关基因集的（几何平均值），表征细胞类型或功能状态（名称显示在热图上方）。方法中详细介绍了如何计算转录分数。圆的面积和颜色对应于Spearman等级相关系数的大小。* P <0.05；** P <0.01；经过Bonferroni校正。n ＝ 78个肿瘤区域。
b: 将来自CRUK0024，CRUK0017和CRUK0069的CD8 TIL分为两个种群：CD45RA–CCR7–PD-1⁺CD57–和所有其他CD8⁺TIL（分别称为PD-1⁺和PD-1–亚群）。显示了代表性患者的流式细胞术控策略。
c: 从排序的群体中提取RNA并进行测序，并针对存在扩展的在和区域性α链和β链序列而提取RNA-seq数据。热图显示在PD-1 PD或PD-1–细胞的RNA-seq数据中发现每个扩展的在或区域性TCR CDR3序列的次数，占该区域恒定区域序列的次数的比例检测到相同的长度。彩色键给出每行缩放的比例，其中每行代表一个不同的扩展TCR序列。
d：从具有高克隆非同义突变负荷的患者（患者L011）中分离出对克隆性新抗原具有反应性的CD8 T细胞。
e：TIL肽的代表性点图：多聚体分类策略（左）和单细胞RNA-seq的工作流程（右）。针对与突变的MTFR2基因产生的肽具有反应性的新抗原反应性T细胞（NART）筛选CD8 TIL，并对其进行单细胞RNA-seq分选。
f：使用Decombinator从单个细胞通过生物信息学方法重建TCRα链和β链序列。新抗原反应性T细胞包括两个具有不同CDR3序列和丰度的细胞家族。
g：热图显示了大量TCR测序数据中来自多聚体阳性（红色）和多聚体阴性（灰色）细胞的肿瘤区域（R1-R3）和非肿瘤肺中抗原特异性β链序列的丰度。每行代表在多聚体阳性或多聚体阴性单细胞中发现的独特TCR。
5.肿瘤内扩增的TCR序列可以在原发肿瘤切除时在匹配的血液样本中鉴定出来，并且可以长期存在于血液中
图5
a：同一患者外周血中检测到的扩展肿瘤内无处不在和区域TCR（α链）的比例在初次NSCLC手术时，患者按降序排列。通过将血液中发现的TCR数除以每种类别的TCR总数来获得比例。因此，我们确保观察到的差异不是由于输入大小引起的。
b：所有患者血液中检测到的扩大的肿瘤内普遍存在（红色圆圈）和肿瘤内的局部区域（灰色圆圈）TCR（α链）的比例摘要。最小值和最大值由箱形图的极点表示；中线由粗水平线表示；第一个和第三个四分位数用框边表示。β链序列的等效图显示在图10a的扩展数据中。
c：在发生以下情况时，外周血中扩大的肿瘤内普遍存在（红色圆圈）和区域（灰色圆圈）TCR（α链）的频率（检测到的TCR序列数，占TCR总数的比例）。NSCLC手术（显示了单侧Mann-Whitney试验P值；n = 23位患者）。仅将血液中实际检测到的TCR用于该分析。最小值和最大值由箱形图的极点表示；中线由粗水平线表示；第一个和第三个四分位数用框边表示。β链的等效图显示在图10b的扩展数据中。
d：在初次NSCLC手术时和常规随访时，在血液中检测到的扩大的肿瘤内无处不在（左）和区域（右）TCR（α链）的比例2岁以下；单侧Mann-Whitney检验P值；n = 14个无处不在的和区域性TCR患者。最小值和最大值由箱形图的极点表示；中线由粗水平线表示；第一个和第三个四分位数用框边表示。β链的等效图显示在图10c的扩展数据中。
e：在初次NSCLC手术时和常规随访时在血液中检测到的扩张性非肿瘤肺TCR（α链）的比例。最小值和最大值由箱形图的极点表示；中线由粗水平线表示；第一个和第三个四分位数用框边表示。β链序列的等效图显示在扩展数据图10c中。
f：CRUK0013（左），CRUK0046（中）和CRUK0048（右）在三个纵向时间点在外周血中具有不同发生方式的扩张型瘤内无处不在TCR（α链）的相对比例。在所有三个时间点发现的扩大的肿瘤内无处不在的TCR以红色显示。
总结：
（1）这项研究强调了非小细胞肺癌中抗肿瘤免疫反应在空间和时间上的动态复杂性，具有重要的临床意义。有助于探索将新抗原反应性T细胞或肿瘤特异性TCR用于过继细胞免疫疗法。
（2）克隆扩增的肿瘤内T细胞的功能异常表型可能表明该T细胞群体随着时间的流逝而失败，并且在没有治疗干预的情况下无法控制肿瘤的生长。因此，将肿瘤内T细胞用于治疗目的将取决于确定普遍存在的TCR并能够成功纠正其功能障碍状态。
（3）在肿瘤切除时经常在血液中检测到许多无处不在表达的扩大的肿瘤内TCR。通过提供一种非侵入性的方法来监测和访问新抗原特异性T细胞以进行个性化的免疫治疗策略，追踪并从血液而非肿瘤组织中分离和分离这些细胞的能力可能有助于改善NSCLC患者的临床结果。
参考文献
Spatial heterogeneity of the T cell receptor repertoire reflects the mutational landscape in lung cancer