SV2补给可缓解C9orf72‐ALS / FTD中甘氨酸丙氨酸二肽诱导的突触功能障碍| EMBO分子医学 / 开普饭

https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/emmm.201910722

论文解释

肌萎缩性侧索硬化症（ALS）（也称为Lou Gehrig病）的患者会失去肌肉控制，因为大脑和脊髓中的神经细胞或神经元退化，无法再向肌肉发送信号。突触中的问题（信号从一个神经元跳到另一个神经元或跳到肌肉的那一点）可能会导致这种情况。但目前尚不清楚是什么原因导致了这些问题。JeffersonWeinberg ALS中心的新研究发现了一种新机制，通过该机制，有毒蛋白质的积累（ALS的共同标志）会破坏神经元的传递。该研究发表在《 EMBO分子医学》杂志上2020年4月29日。

问题：恢复ALS中的神经肌肉通讯

日期：2020年5月28日

C9orf72基因中的六核苷酸重复扩展是家族性和明显散发性ALS病例的最常见原因。尽管有证据表明C9orf72蛋白水平的功能丧失单倍不足可能会导致免疫学问题，但由于RNA病灶的由于许多C9orf72患者属于散发性ALS，而积累和二肽重复蛋白（DPR）的聚集导致的功能获得性毒性作用都是由于RNA复制物的异常扩展导致的是运动神经元死亡背后的潜在致病元凶。队列，因此在诊断时他们拥有很高的DPR负担。这些DPR中含量最高的是GA二肽，它会引起逐渐的细胞毒性。

结果

在这里，我们显示出移动GA聚集体存在于皮质和运动神经元的细胞质和轴突中。在功能研究中，我们发现GA的表达导致Ca ^2+的增加涌入，但对神经元放电的刺激反应减少了突触卸载。突触蛋白的检查显示，突触囊泡相关蛋白2（SV2）明显减少。尽管含有GA的神经元最终屈服于毒性，但在死亡之前几天，突触蛋白和传导缺陷就出现了。重要的是，如果我们恢复了表达GA的细胞中的SV2水平，我们就能成功恢复突触功能并防止神经元死亡。我们验证了20个月大的GA转基因小鼠中SV2的减少，而没有运动神经元的丢失。最后，我们证实了C9orf72-ALS患者诱导的皮质和运动神经元中SV2的特异性丧失。

影响力

了解并针对丰富且逐渐有毒的DPR引起的细胞后果，GA可能是C9orf72‐ALS患者的有前途的治疗选择。在隔离由GA引起的突触缺陷的分子机制中，我们为将来鉴定干预疗法提供了基础，这些干预疗法专门用于维持运动神经元-肌肉连接所需的突触，从而延长C9orf72-ALS患者的肌肉强度。

介绍

C9orf72基因中的内含子六核苷酸重复扩增（GGGGCC）_n是肌萎缩性侧索硬化症（ALS）和额度痴呆（FTD）的最常见遗传原因（Couthouis等人，2011； DeJesus- Hernandez等人，2011； Renton等人，2011年）。现有证据支持与这种致病性扩展有关的另一种致病机理：（i）由于C9orf72 mRNA表达水平下降而导致其功能丧失机制（Ciura）等，2013； Therrien等，2013； Shi）等人，2018）；（ii）扩大区域产生的RNA转录本通过形成抑制转录的RNA-DNA杂合体和/或通过隔离核病灶中的RNA结合蛋白来获得毒性功能（Gendron等，2013；Gitler＆Tsuiji，2016年）；（iii）通过重复相关的非AUG翻译，扩展的RNA转录本可编码6种二肽重复（DPR）蛋白（感觉：聚甘氨酸丙氨酸或GA，聚甘氨酸精氨酸或GR，聚甘氨酸脯氨酸氨酸或GP；反义：聚脯氨酸-精氨酸或PR，聚脯氨酸-丙氨酸或PA和聚脯氨酸-甘氨酸或PG），它们在不同的有机体和细胞培养系统中显示出不同的毒性特征（Ash等，2013； Mori等），2013；祖等，2013；Mizielinska等，2014 ; HAEUSLER等人，2016年;温等人，2017）。每一种机制所调用广泛的细胞反应的，并且在一些情况下，在神经元的毒性和认知和运动功能障碍类似于人类疾病表型（高潮权等人，2014；Mizielinska等人，2014 ;闻等人，2014，2017年;道等人，2015）。

在C9orf72-ALS中，作为早期事件的功能障碍性神经肌肉接头（NMJ）传播的证据越来越多（Sareen等，2013； Devlin等，2015）。一点的是，在果蝇果蝇幼虫中的进行两项独立研究调查了表达GGGGCC重复序列的动物中NMJ的结构特征。在这些研究中，两组均报告了表达30个或更多GGGGCC重复序列的幼虫中NMJ活动区数量的急剧减少（ Freibaum等，2015； Zhang等，2015）。详细分析还显示，突触钮扣数量明显减少（Freibaum等人，2015），以及减少的突触定量分量导致电位衰减（Zhang等，2015）。然而，尚不清楚这些作用是否是由于扩展的RNA转录物，DPR或所有协同作用的功能的毒性增加所致。根据最近在体外和动物模型中研究这些潜在致病机制的大量报道，现已将重点放在更好地研究DPR的作用及其潜在致病性后果上（基特勒和Tsuiji，2016 ; Freibaum和泰勒，2017 ; Gerler＆Tsuiji，2016）。温等人，2017）。因此，在这里中，我们选择将关于C9orf72重复扩展对突触功能的影响的机制分析限制在DPR介导的病理变化的作用上，而同时同时存在含GGGGCC重复序列的RNA复制本而没有潜在的替代。

积累了DPR的体内和体外作用的大量证据，指出了这些二肽的致病作用（Kwon等，2014；Mizielinska等，2014；温等，2014；陶等，2015；Boeynaems等，2016；Schludi等，2017）。在飞行模型和原代神经元中，含精氨酸的DPR（GR和PR）引起最强的毒性（Mizielinska等，2014； Wen等，2014年；Boeynaems等人，2016年）。GR和PR都在细胞核中形成聚集体，并导致一系列细胞异常，包括核转运缺陷，蛋白质错位，RNA加工改变和核仁压力（Kwon等人，2014年；陶等人，2015年；金＆泰勒，2017年年））。遗传毒性虽然不那么明显，但它也通过内质网应激，蛋白酶体损伤以及Unc119，HR23和核质转运蛋白的隔离而导致神经元功能障碍（五月等，2014 ;张等，2016）。）。相比之下，PA和GP / PG的毒性作用很小或没有（祖等，2013 ;文等，2014）。

虽然在C9orf72‐ALS / FTD患者的整个中枢神经系统中都检测到了DPR夹杂物，但最广泛和最广泛观察到的是GA ⁺夹杂物（Ash等人，2013年；Gendron等人，2013年；森等人，2013年；Zu等人，2013）。与加入精氨酸的DPR的表达产生的强烈毒性相反，GA介导的细胞损伤似乎更为微妙。两种小鼠模型已经独立证明了到6个月大时源自神经元GA表达的运动缺陷。当堆积皮革时，GA ₅₀聚集体导致神经元丧失，脑萎缩以及轻度运动和认知行为缺陷（Liu等人，2016），而当在脊髓和脑干中时表达时，GA ₁₄₉阳性的聚集体在缺乏明显的神经元丧失的情况下会引发明显的运动缺陷（Schludi等人，2017）。根据此研究，我们的发现表明，在体内运动神经元中，GA介导的突触缺陷可能在细胞死亡之前发生（Schludi等人，2017）。这种可能性凸显了更深入的研究应对在细胞死亡前可能在治疗窗户中植入的机制。

我们和其他人先前已经证明，原代神经元中的GA表达通过蛋白酶体损伤和ER应激导致神经突增生长和细胞毒性降低（May等，2014； Zhang等，2014）。但是，尚未研究GA包涵体对神经元信号的影响。在本研究中，我们已经证明GA聚集体在轴突和树突状神经元区室中是可移动的。这些表达GA聚集体的神经元显示破坏的Ca ²⁺大量涌入，突触小泡相关蛋白2（SV2）选择性下调，突触释放减少和死亡风险增加。通过对来自GA ₁₄₉转基因小鼠的脊髓进行免疫分析并在神经肌肉接头处进行突触染色，显示出异常的步态和进行性平衡障碍，但没有明显的神经元丢失，我们证实了SV2表达的选择性丧失。这种，我们已将研究结果扩展到患者来源的细胞，其中可能完全发挥C9orf72重复扩展的致病机制。在分化为皮层或运动神经元的诱导多能干细胞中，与对照细胞分裂，源自C9orf72重复扩展的神经元再次表现出SV2水平的尺寸降低。这些体内和患者来源的对我们发现的验证表明，这种分子表型可能是疾病症状的前驱发展基础或促成疾病发展。最关键的是，我们能够通过在表达GA的原代神经元中有针对性地上调SV2来恢复突触功能并挽救细胞毒性。这些发现表明，即使在GA聚集体持续存在的情况下，GA介导的SV2水平和定位的改变也是可逆的过程，神经元可以从中恢复。

结果

在神经元的轴突和树突中发现了GA夹杂物

表达GA _149- myc基因的未成熟初级皮层神经元型态（DIV4）显示出降低的树突复杂性和凋亡迹象（五月等，2014）。然而，在成熟的原代皮层皮质（以7 DIV转染）和运动神经元（以5 DIV转染）的广泛GA重复长度响应曲线中，在第7天或第3天，最多400次重复的任何GA长度都没有观察到明显的毒性转染后（Wen等，2014）。我们还注意到在GA _{149 ‐} CFP表达的动物模型中，这些小鼠在没有神经元丢失的情况下出现了行为和运动异常，例如步态异常和进行性平衡障碍（Schludi等人，，2017），表明神经元活动异常。

我们和其他人已经确定，GA在多个细胞系和原代插入齿动物神经元中表达时，会形成致密的胞质聚集体（May等，2014； Wen等，2014； Zhang等，2014）。确实。，即使从细胞传播到细胞，GA仍保持细胞质积累和聚集的趋势（常等，2016 ; Westergard等，2016）。由于有丝分裂后神经元具有独特的形态以及复杂的轴突和树突状乔木构架，因此在我们以前的工作中，我们还以高空间分辨率检查了表达GA的神经元（Wen等，2014年）。表达GA ₅₀（eGFP标签）的成熟皮质和运动神经元用神经元标记SMI- 32复染。有趣的是，除细胞体中的细胞质聚集体外，神经突中还存在eGFP-GA包涵体（Wen等，2014）。这种定位模式对于GA二肽是独特的，因为我们在神经过程中未观察到任何其他二肽（温等，2014）。为了开始本研究，为了确定时间的推移在神经突中是否发现了聚GA聚集体，我们对聚集体进行了预先评估，其中GA ₅₀在成熟的皮质神经元中表达α -β，并在特定时间点对细胞亚群进行固定和染色。细胞用SMI-32复染。在检查的所有时间点（表达的2、4或8天），在神经区域都可以发现独特的eGFP ⁺ GA聚集体（图 1）。我们证实，即使经过8天的表达，没有相关GA肽的GFP单独也不会诱导GFP聚集。在eGFP表达8天后，在对照细胞中仍可见弥漫性的，充满细胞的GFP表达（图 EV1一种）。定量显示含有神经聚集体的含有GA聚集体的细胞的百分比表明，在表达2天后，表达皮质GA的神经元中有66.93％±5.57％的神经突具有聚集聚集体。在之下，成熟运动神经元的相同转染表明，表达GA的运动神经元在表达后2天有55.62％±6.70％的神经元聚集。接着，我们想确定GA聚合随身时间的稳定性。成熟皮质神经元（DIV10）与eGFP或eGFP‐GA ₅₀共转染以及一个由突触蛋白启动子驱动的Td的番茄细胞填充报告基因。24小时后，通过的eGFP和TD-番茄的共阳性鉴定出转染的神经元。然后每24小时观察一次相同的神经元，持续8天。我们观察到，GA内含物可随其形成的神经元随时间清除（图 EV1 B）。

图1.通过时间的加速度，在皮革神经元神经突中检测到GA ₅₀聚集体

了检查转染EGFP-GA _50的原代大鼠皮质神经元型态，以确定在神经突中发现细胞死亡聚集之前的时间点。转染后两天，在神经突中可检测到的eGFP-GA ₅₀（绿色）形成的聚集体（SMI-32染色为红色）。这些聚集体在96小时（4天）和288小时（8天）保持局部于神经突。共定位由黄色覆盖（右图）表示。每一个图像下方的插图显示了包含聚集体的神经突触区域的扩大，来自60倍放大z横向共聚焦图像的代表场，比例尺指示20μm。插图比例尺指示5μm。

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GA聚集体在神经突内移动

神经元内动态GA聚集体的存在提示特定于神经元细胞谱系的其他可能的有害后果，包括蛋白质和细胞器向突触末端的细胞运输改变以及突触传递功能障碍。为了探究这些问题，我们采用了多种活细胞成像功能测定和共聚焦成像评估涉及神经传递的突触相关蛋白。

我们使用高质量的活细胞成像来监视神经突内不同货物的运输，我们首先评估了遗传算法集聚体本身是可移动的还是固定的，遗传算法重复的长度是否会决定这种可移动性。将不同长度的GA分别转染到DIV7和DIV5的成熟皮层或运动神经元中。如前所述（闻等人，2014），目前我们实验中使用的EGFP-GA _ñ的长度范围为25至400一个重复。这些重建体的序列是根据随机密码子策略设计的，以生成具有指定重复长度的指定替换序列，但要避免GGGGCC在相应的RNA重复重复扩展（文等人，2014）。带有eGFP通道的明场图像重叠图清楚地显示了两个细胞群的神经区域内不同的GA聚集体（图 2 A和B）。在表达48小时后，以快速帧速率拍摄了高分辨率的60倍图像，从而可以随时间跟踪细分eGFP ⁺ GA颗粒的位置（NIH ImageJ软件）。在皮层神经元中，短GA重复长度（25–50）的聚集体沿神经突具有较高的迁移率，而扩展GA重复序列（100–400）的聚集体则更稳定（** P <0.01；图 2 C）。同样，在原代运动神经元中也观察到重复的长度依赖于GA粒子速度（**** P <0.0001;图 2 d）。接下来，我们评估了神经遗传性GA聚集体的存在是否构成了沿微管正常运输细胞器货物的障碍。从而，我们用长度不断增加的eGFP‐GA _n重复序列转染了培养物，随后用可渗透细胞的染料MitoTracker深红色标记了线粒体，用可渗透性染料Lysotracker深红色标记了溶酶体，或用SYTO RNASelect绿色标记了总RNA。鉴定出的eGFP ⁺神经元，并使用适合的MitoTracker染料激发光谱的637激光通道可视化线粒体。来自皮层神经元的代表性图像显示了神经元的eGFP-GA聚集体和用的MitoTracker染料进行独特的线粒体标记（图 EV2 ）一种）。以类似的方式，鉴定出的eGFP ⁺神经元，并使用适合溶酶体示踪剂染料激发光谱的637激光通道可视化溶酶体。皮质神经元的代表性图像显示了神经元的eGFP-GA聚集体和独特的溶酶体标记（图 EV2 B）。与GA聚集体本身相反，线粒体的迁移性不受神经突中GA夹杂物的影响。在整个GA长度曲线以及仅表达GFP的对照中比较了线粒体的活动性，显示皮质神经元（图EV2 C）或运动神经元（图 EV2 D）在48小时无变化。对溶酶体迁移率进行相同的分析表明，只有GA ₄₀₀含有皮层神经元的人的活动度显着降低（* P <0.01;图 EV2 E）。我们还通过使用SYTO RNASelect染料标记在mCherry的或对照表达mCherry-GA _50的皮质神经元中评估了总细胞RNA的迁移性（图 EV2 F）。经过分析，我们再次发现表达GA的细胞的总RNA迁移率没有缺陷。因此，我们已经确定了GA聚集体沿着皮革和运动神经元过程移动，而不会显着着影响对于细胞存活至关重要的货物运输动力学。

图2.来自短GA _25-50重复长度的聚集体是可移动的，而来自重复重复序列的聚集体则更固定

在EGFP-GA _Ñ表达48小时后，对原代大鼠皮层和运动神经元进行活细胞成像，以确定神经突内的聚集性。

一种。以亮视野覆盖，放大60倍，比例尺指示为10μm的皮质神经元表达EGFP-GA ₁₀₀（绿色）的示例。右上角的插图显示了方框区域的扩大，以便更好地可视化神经元过程中的聚集体。插入比例尺指示5μm。

B. 表示运动神经元的示例，其中的eGFP-GA ₂₅（绿色）具有明场覆盖，放大60倍，比例尺表示10μm的。右上角的插图显示了方框区域的扩大，以便更好地可视化神经元过程中的聚集体。插入比例尺指示5μm。

C。皮革神经元神经突内eGFP‐GAn聚集速度的定量分析。

D．运动神经元神经突内eGFP‐GAn聚集速度的定量。

数据信息。数据表示为平均值±SEM单向方差分析，事后邓尼特多重比较检验，** P <0.01，**** P <0.0001。确切的P值柯林斯在附录表S1中找到。从每个神经元族中每个GA重复长度的三个生物学重复中的每一个，评估来自10个聚集体的速度测量值。

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含GA的神经元显示缓慢毒性

我们想要验证这些体外报道的表型是神经元固有的GA替代机制的结果，而不是已经承诺在GA表达后死亡的细胞中发生的继发现象。

因此，我们研究了表达GA的神经元的初步存活率。成熟的皮质神经元（DIV7）或运动神经元（DIV5）与eGFP，eGFP-GA ₅₀或eGFP-GA ₁₀₀以及突触蛋白启动子驱动的TD-细胞番茄填充报告扩展基因共转染。24小时后，通过的eGFP和TD-番茄的共阳性鉴定出转染的神经元。然后每隔24小时将相同的神经元可视化一次，分别持续13天（皮质神经元）和10天（运动神经元）。GA ₅₀或GA _100的表达仅在转染后13天（DIV23）（图3甲和B）和转染后10天（DIV15）的运动神经元存活率导致统计学上显着降低其存活百分率（图 3 C）与仅表达GFP的神经元分数。随着时间的位移，这会转化为神经元的逐渐丧失，这可以在特定图像中清楚地看到（标有白色箭头），并通过Kaplan–Meier生存曲线分析和对通过多个独立实验组装的多个神经元的对数秩检验进行了确认（**** P ＜0.0001；图 3）。皮质神经元第13天的危险比表明，GA ₅₀（1.677）和GA ₁₀₀均增加了死亡风险（1.263）条件。类似地，运动神经元在第10天的危险比显示死亡风险增加，GA长度分别为1.345和1.736。虽然我们观察到了运动神经元毒性的长度相关性增加，但皮层神经元却不是这种情况。我们造成这是由于GA ₅₀聚集体在这些细胞中的高负担和流动性所致。因此，我们观察到的GA诱导的细胞死亡发生的时间远远晚于展示移动性神经聚集体的时间范围（转染后2天）。这暗示了这些聚集体有可能影响正常神经元功能的时间窗口。

图3.含polyGA的神经元显示延迟的细胞死亡曲线

将大鼠原代神经元与Td-tomato和eGFP-GA _n质粒或单独的eGFP共转染。相同的神经元每隔24小时成像一次以评估生存能力。

一种。转染后第1、7和13天，eGFP和eGFP-GA ₅₀皮质神经元的局部区域（右）随时间转移跟踪交替细胞的存活（白色箭头）。放大倍数20倍，比例尺指示25微米。

B．转染后13天，对皮革神经元进行Kaplan-Meier生存分析。

C。转染后5天进行运动神经元的Kaplan-Meier生存分析。

数据信息：通过Cox比例风险比和Mantel-Cox对数秩检验进行统计分析。分别显示神经元数量（＃），危险比（HR），Cox比例危险P值（P），置信区间（95％CI））和对数秩P值（LRP）的表的Kaplan Meier曲线。通过合并ñ = 6独立个实验评估每种条件下至少600个细胞，**** P <0.0001。确切的P值柯林斯在附录表S1中找到。

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含有GA聚集体的神经元的突触释放受到损害

为了评估GA聚集体在神经元过程中的功能后果，我们诉诸活细胞成像和刺激范例来评估突触释放和eGFP的树突和轴突中GA夹杂物的合理结果是突触神经传递的扭曲乱。-GA _ñ构建体与可渗透细胞的染料FM4-64结合的长度曲线。在EGFP-GA _ñ表达48小时后，细胞中会装载这种染料，这种染料会积聚在突触小泡中，并可作为小泡胞吐作用的读数（Gaffield＆贝兹，2006 ; Verstreken等，2008）（图 4。A）的eGFP的⁺鉴定出细胞，并监测每个细胞每个目标区域中装有FM4-64的10个突触点。获得基线测量值，然后用高ķ ⁺ ACSF溶液灌注以诱导突触发射状语从句：染料卸载（图 4的B）。动力学表示为荧光（ΔF）相对于基础荧光（F）的变化（损失图显示在刺激过程中eGFP‐GA ₅₀与表达eGFP的神经元评分（图 4 C）。评估表达GA肽的皮层神经元揭示突触小泡释放的惊人废除。与单独的eGFP的相比，其将荧光信号降低到预刺激水平的74.7％±3.3％，所有GA长度都显着削弱FM4- 64染料的释放（GA ₂₅：94.5％±1.6％，GA ₅₀：103.1％±1.7％，GA ₁₀₀：97.4％±2.8％，GA ₂₀₀：94.1％±2.5％，GA ₄₀₀：99.6％±0.5％）（*** P ＜0.001）。生成，通过基于平台的非线性回归以及一阶段衰变模型进行的分析，包含GA聚集体的细胞的衰变率显着降低。而刺激期间eGFP细胞的衰减常数（k ）为0.497 s ^-1，这在包含GA ₅₀的细胞中急剧增加至219.5 s ^-1。这些结果表明，包含GA的细胞未有效执行神经元放电信号。但是，我们尚不能排除这是无效的信号扭曲还是突触释放的错误。

图4。GA聚集严重损害突触卸载

转染后48小时，皮革神经元上植入FM4-64染料。在通过包含50mM KCl的ACSF植入诱导去取代之前，监测基础荧光。

一种。最佳的染料负载显示沿神经突40倍放大的定义的点状区域，比例尺指示10μm。

B．刺激前和刺激后FM4-64泪点区域的特定强度表明，在eGFP刺激下，但未在含有GA ₅₀的神经元刺激下，突波的荧光强度丧失。这些图像通过我们的成像软件以可视方式反映以自动化方式执行的过程，以确定点状荧光强度。每个实验在每个图像上放置一个无偏常数阈值; 。随然后时间测量荧光强度所应用的阈值将点与主页背景隔离开来，从而告知了不同的区域。对8位图像进行阈值处理，变成伪彩色（红色）被视为的点状放大区域，比例尺表示10μm。

C。图形表示是标准化为基础荧光（F）的荧光（ΔF）的变化ΔF/F。显示了最后10秒的位移记录和10秒的去偏振阶段。箭头指示开始去极化。非线性回归是在的GraphPad Prism7中使用平台，然后是单相衰减模型进行的。eGFP的的衰减常数（k）的为0.4971小号^-1，而GA ₅₀的衰减常数为219.5小号^-1。同样，eGFP的tau蛋白的（τ）值和GA ₅₀的tau（τ）值分别为0.00455 s 。数据表示为每个成像时间点的偏移±SEM。使用Sidak–Bonferroni方法确定统计学显着性，**** P <0.0001，n =来自四个生物学重复的20个点状区域。正确的P值可在附录表S1中找到。

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具有GA聚集体的神经元显示出增加的Ca ^2+内流

公认的是，当发生足够的去极化以触发神经元中的动作电位时，需要Ca ^2+内流来使突触小泡适当融合并释放神经递质（Schneggenburger＆Rosenmund，2015）。为了确定我们在含GA的细胞中观察到的突触卸载失败是否是Ca ²⁺进入改变的结果，采用了活细胞成像范例，其中将mCherry标签的GA构建体与GCaMP Ca ²⁺指示剂共转染。。表达48小时后，根据双重mCherry和GCaMP信号选择共转染的细胞进行成像（图 5 A）。在基础GCaMP荧光记录之后，向神经元灌注高K ⁺包含Ca ²⁺（1.33 mM）的ACSF溶液触发神经元去极化。在这样的刺激之后，记录了细胞内Ca ²⁺信号的强烈激增（图 5A）。确定每个刺激细胞的GCaMP荧光强度相对于基线的最大变化的定量，并针对每种条件编译20个细胞。在皮质和运动神经元中，与仅表达mCherry的对照细胞相比，在含有mCherry-GA ₅₀的细胞中观察到细胞内Ca ²⁺信号显着增加（* P <0.05，** P <0.01；图 5B和C）。接下来，我们试图确定该增加的Ca ²⁺信号是否存在GA长度依赖性。每组构建体的GA长度曲线均与我们的GCaMP报告基因构建体共转染。在对该系列的基线上GCaMP荧光强度的最大变化进行定量之后，我们确定，虽然GA长度各自均导致Ca ²⁺流入量显着增加，但它们之间的变化幅度没有显着差异（图 EV3 A ）。为了确定增加的荧光信号是否是由于Ca ²⁺流入神经元引起的，在缺乏游离Ca ^2+的高K ⁺ ACSF中进行细胞刺激。在这些条件下，未发现对照mCherry细胞和含有mCherry-GA ₅₀的细胞之间存在显着差异，这表明进入细胞的细胞外Ca ²⁺确实是神经元内部Ca ²⁺激增的原因（图 5 B和C）。因此，与我们基于抑制突触卸载的预期相反，我们发现表达GA二肽的皮质和运动神经元的Ca ^2+内流明显增加。

图5.含有GA聚集体的神经元中Ca ^2+内流增加

原代皮层或运动神经元与mCherry或mCherry-GA ₅₀和GCaMP6f共转染。48小时后，确定mCherry阳性细胞。然后从已识别的神经元记录绿色荧光强度。在通过含50mM KCl的ACSF灌注诱导去极化之前，监测基础荧光。

一种。共转染的表达mCherry-GA ₅₀（左图）和GCaMP6f（右两图）的皮质神经元的代表性图像。此图像显示了刺激前后GCaMP6f指示剂可检测到的绿色荧光增加的代表性例证（分别为中心和右边）。放大倍率40倍，比例尺指示25μm。

B，C。 ACSF灌注后荧光的峰值变化（ΔF）的图形表示，已标准化为基础荧光（F），ΔF/ F。Ca ²⁺流入的贡献是通过在含高KCl但不含Ca ^2+的ACSF中进行刺激的实验确定的。皮质神经元（B）和运动神经元（C）中荧光峰变化的量化。

数据信息：数据表示为平均值±SEM。单向方差分析与未经校正的费舍尔LSD测试，* P <0.05，** P <0.01。从八个独立实验中，每种条件下总共收集了20个细胞。确切的P值可在附录表S1中找到。

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体外表达GA的神经元中突触小泡相关蛋白2（SV2）减少

在表达GA的神经元中异常增加的Ca ^2+内流促使我们检查突触蛋白是否受到影响，因为改变的Ca ²⁺稳态和信号传导可能对突触释放和囊泡融合事件产生重大影响（Zundorf＆Reiser，2011； Schneggenburger ＆Rosenmund，2015）。我们研究了eGFP‐GA _n的表达是否影响我们皮质和运动神经元体外范式中突触小泡成分蛋白的水平以及神经形态。最初用于探索的三种蛋白质，突触素，突触囊泡相关蛋白2（SV2）和PSD-95，在突触传递中起着至关重要的作用。SV2是活性区和突触释放机制的关键组成部分，因为它与其他囊泡成分突触素，突触标签蛋白和突触短纤维形成复合物（Mutch等人，2011 ; Kwon＆Chapman，2012 ; Li＆Kavalali，2017）。虽然人类基因组中编码了SV2的3种亚型，但SV2a在大脑中分布最广泛，是几种药物化合物的靶标（Crevecoeur等，2013）。这种同工型一直是我们实验的重点，在本文中将其简称为SV2。SV2还被认为是神经递质导入突触小泡的转运蛋白（Feany et al，1992），并且在通过与电压门控的Ca ²⁺通道相互作用而维持适当的机制使Ca ²⁺进入突触中起着不可或缺的作用（Vogl等人，2015）。此外，通过与层粘连蛋白和层粘连蛋白相关蛋白的结合，SV2特异性参与突触的再神经支配（Son等，2000； Singhal＆Martin，2011年）。）。突触素也是突触小泡的重要组成部分，也是最丰富的蛋白质之一，占总小泡含量的8％（Evans＆Cousin，2005）。认为突触素不是促进诱发的神经递质释放，而是在水泡再循环中起作用（Evans＆Cousin，2005）。同样重要的区域是突触后密度，因为这是信号转导事件的传递点。PSD-95是突触后密度的关键结构组成部分，是我们在该细胞区域中潜在变化的标志。据认为，PSD-95通过组成蛋白（例如AMPA受体，NMDA受体，粘附分子和其他支架蛋白）的结合在突触后密度的组织中发挥作用（Chen等，2011）。成熟的皮层和运动神经元用我们不同长度的eGFP-GA _n构建体转染，并对这些突触蛋白进行了免疫染色。通过共聚焦显微镜观察，然后计数每个eGFP ⁺的阳性点数细胞显示皮质和运动神经元中SV2水平显着降低了GA重复长度，这与GA重复长度有关（**** P <0.0001；图 6 A–D）。总神经突长度不受任何重复长度的GA表达的影响，确保这是每神经突长度减少突触蛋白含量，而不是总神经突面积减少（图 6 C和D；右图）。与单独的eGFP或整个GA长度曲线相比，突触素和PSD-95的水平没有变化（图 EV3）B和C）。总体而言，在所检查的突触蛋白中，在初级皮层和运动神经元中均观察到了SV2的特异性且明显的长度依赖性减少。我们已经开始通过评估GA与SV2蛋白和mRNA的共定位来解决GA表达与SV2改变的水平和定位之间的潜在机制联系。在用我们的mCherry-GA ₅₀构建体转染并如上所述在第2天染色的皮质神经元中，我们还评估了SMI-32神经区域内GA与SV2蛋白的共定位（图 EV4）一种）。GA长度曲线上的定量显示，在所有GA长度下，一小部分的SV2蛋白被隔离到GA聚集物中，约占总细胞SV2的3.5％。为了评估GA与SV2 mRNA的可能相互作用，生成了针对SV2 mRNA的定制信标探针（Bio-Synthesis，Inc.）。将该信标与我们的eGFP-GA ₅₀构建体一起共转染，并在GA表达2天后评估细胞的共定位作用（图 EV4 B）。我们发现，表达GA的细胞中有20.97％±2.67％的RNA信标与GA共定位。这些有趣的发现将有助于指导未来研究中GA相互作用的广泛深入评估。

图6.含有神经元的GA聚集体中突触小泡成分SV2减少

eGFP‐GA _n二肽在原代皮层或运动神经元中表达48小时，然后免疫染色以检测神经丝（灰色）和SV2（红色）。

A，B 代表皮层（A）或运动（B）神经元的eGFP，eGFP-GA ₅₀和eGFP-GA100的神经突的代表性z堆栈共聚焦图像。放大60倍，比例尺指示5μm。

C，d 通过ImageJ的手动计数对皮层神经元（C）或运动神经元（d）中的神经突沿SV2突点进行定量，并标准化为仅表达eGFP的的细胞。（C）皮质神经元表现出显着的GA长度减少减少，以及所有包含GA重复数大于50的细胞减少（左图）。（D）运动神经元表现出显着的GA长度减少减少，以及所有包含GA重复数大于100的细胞减少（左图）。通过NeuronJ软件对神经突长度的评估显示，与单独的eGFP的相比，表达任何GA重复长度的皮质神经元（C）或运动神经元（d）的每个细胞的总神经突长度没有差异（右图）。

数据信息。数据表示为平均值±SEM单向方差分析，事后邓尼特多重比较测试，**** P <0.0001，Ñ = 3个独立的生物学重复，米 =每个重复5-7个细胞。精确的P值可在附录表S1中找到。

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C9orf72‐ALS患者来源的iPS神经元中的SV2减少

接下来，我们希望验证我们的发现与C9orf72‐ALS患者在生理上相关。我们获得了C9orf72‐ALS患者的i3 iPS品系，并去除了GGGGCC重复扩增的配对等基因品系（Fernandopulle等，2018）。这些细胞根据先前定义的方案扩增并分化为皮层神经元，并在体外成熟21天。此时，通过免疫荧光，qPCR和免疫印迹。探测盖玻片上的皮质i3神经元的SV2或突触素，并用神经丝复染。通过共聚焦显微镜观察，然后定量与神经丝共定位的突触蛋白。该分析表明，与等基因对照相比，在具有C9orf72重复扩增的神经元中SV2再次被特异性还原（* P <0.05；图 7 A和C），而突触素水平保持不变（图 7 B和D）。我们还测试了两个i3品系此时SV2的总体mRNA水平。在C9品系中，SV2 mRNA与配对的同基因品系相比降低了0.249倍（** P <0.01；图 7E）。我们还通过准备细胞裂解液并用SV2探针免疫印迹这些样品来评估SV2的蛋白水平。通过光密度分析与总蛋白负载量进行比较，我们发现与等基因系相比，SV2蛋白降低到0.578倍（* P <0.05；图 7 F）。为了评估这些发现是否也适用于iPS衍生的运动神经元，通过Answer ALS联盟从32天分化对照和C9orf72‐ALS iMN中获得了细胞沉淀。用SV2和突触素的探针对源自这些全细胞裂解液的样品进行的免疫印迹显示SV2水平有降低的趋势（P = 0.1116）（图 7）G和H）。值得注意的是，该分析是使用与基因无关的C9orf72-ALS和对照品系进行的，使用的协议产生的混合神经元种群中具有20％至30％Islet1 ⁺运动神经元。如果可以提高分化效率，SV2的减少可能会更加明显。总体而言，在C9orf72重复扩增导致的总细胞后果的背景下，源自患者的iPSC系的这些发现支持了我们的SV2发现。

图7. C9orf72‐ALS患者的i3神经元中的SV2减少

A，B 将C9orf72‐ALS患者的i3皮质神经元和配对的同基因对照分化21天，然后对神经丝（红色）和SV2（绿色）（A）或突触素（绿色）（B）进行免疫染色。显示的是神经突的代表性z堆栈共聚焦图像。

C，D 与标准化为神经丝区域的神经丝共定位的SV2（C）或突触素（D）的定量。该分析表明与同基因对照相比，C9orf72细胞系中SV2水平显着降低，而突触素保持不变。数据表示为平均值±SEM。不成对t检验，* P <0.05。评估了每种基因型来自三个分化孔的15个非重叠区域。

E． mRNA是从C9-ALS和同基因i3皮质神经元的三个独立孔中提取的Trizol。使用Superscript First-strand试剂盒将RNA转换为cDNA，并使用PowerUp SYBR Green进行qPCR。将测量标准化为管家基因GAPDH，然后标准化为等基因水平。使用ΔΔCT方法进行分析。2 ^ΔΔCT ±SE给出。未配对t检验，** P <0.01。

F。全细胞裂解物从C9-ALS的三个独立孔中产生，并分化了21天的同基因i3皮质神经元。裂解液针对SV2进行免疫印迹，并标准化至总蛋白上样量。带强度的定量显示与同基因相比，C9orf72品系中SV2蛋白水平显着降低。数据表示为平均值±SEM。不成对t检验，* P <0.05。

G，H。从分化32天的iMN产生全细胞裂解液。裂解液针对SV2（G）或突触素（H）进行免疫印迹。负载对照是β-肌动蛋白或总蛋白负载。相对于上样对照标准化的定量条带强度显示出与对照相比，C9orf72细胞系中SV2蛋白水平降低的趋势，而突触素水平保持不变。数据表示为平均值±SEM。未配对的t检验。使用来自五个独立的对照和四个独立的C9orf72患者系的样品。确切的P值可在附录表S1中找到。

此图可在线获得源数据。

图7的源数据 [emmm201910722-sup-0003-SDataFig7.pdf]

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补充SV2可恢复突触功能并减轻细胞毒性

接下来，我们试图确定表达GA的细胞中SV2水平的降低是否是通过慢病毒转导皮质和运动神经元来恢复SV2水平，从而成为治疗干预的可行分子候选物。我们获得了rSV2a-eGFP-pRRL质粒构建体，该构建体先前已被证明可以在体外强烈表达大鼠SV2a （Yao等，2010）。从该构建体中产生SV2慢病毒后，我们感染了成熟的皮质神经元，并在表达4天后分别通过qPCR和免疫印迹分析了它们在mRNA和蛋白质水平上SV2上调的能力。与未转导的对照细胞相比，我们观察到SV2 mRNA显着增加1.99倍（** P <0.01）以及SV2蛋白的1.72倍显着增加（*** P <0.001;图 EV4 C和D）。

我们选择使用GA ₅₀作为代表GA长度来评估任何拯救表型，因为它在体外显示出强大的细胞效应。最初，我们通过表达2天后的免疫荧光染色和分析，检查了在含有GA ₅₀的SV2 _pRRL转导的神经元中，是否恢复了SV2点的水平。我们发现，通过这种外源性SV2表达，在含GA的细胞中观察到的SV2点明显减少已归一化为对照水平（图 EV4 E和F）。甚至含GA ₅₀的细胞中的SV2水平仍显着低于其用SV2 _pRRL转导的对照细胞（**** P <0.0001），与正常对照神经元相当的水平提示了突触功能恢复的潜力。通过使用相同的活细胞成像技术，我们最初详细描述了突触释放的破坏，改变的钙^2+内流神经状语从句：元型态毒性，然后确定了SV2水平的恢复是否能够挽救这些细胞缺陷。首先，将成熟的皮质神经元用eGFP或eGFP-GA₅₀转染，并与SV2 _pRRL慢病毒共转染。表达2天后，再次使用我们的FM4-64染料范例测量突触释放。当神经元共表达GA ₅₀ + SV2 _pRRL时，表达GA的细胞中突触释放的消除单独的_50个被恢复至与对照GFP神经元相当的水平（*** P ＜0.001；图 8A）。在mCherry-GA ₅₀和gCAMP以及SV2 _pRRL的共转染后2天，还评估了钙的流入。与突触释放结果相似，当神经元共表达GA ₅₀ + SV2 _pRRL时，钙^2+内流增加引起单独的GA ₅₀表达得以恢复至与对照神经元型态相当的水平（*** P <0.001 ；；图 8 B）。最后，对皮革和运动神经元的细胞毒性进行了初步评估，转化为SV2水平的恢复是否会影响由GA引起的细胞毒性。相应于我们的图3立即生存测定相同的原理，将成熟的皮质和运动神经元与mCherry或mCherry-GA _n共转染，并通过SV2 _pRRL慢病毒转导在存在或不存在SV2的情况下评估随时间的存活率。在皮层神经元中，通过表达SV2 _pRRL来恢复SV2的水平，可以挽救GA ₅₀的明显细胞毒性，其危险比从GA _50的1.473降至SV2 _{pRRL的0.7277}共表达（**** P <0.0001）（图 8 C）。作为对照，在有或没有SV2 _pRRL共表达的神经元中也表达了有毒的C9orf72二肽PR ₅₀，以确定这是否是特定的GA介导的结果。评估含有PR ₅₀的神经元的存活率发现，无论是否使用SV2 _pRRL，观察到的存活率均显着降低，PR _50的危险比分别为1.772和PR ₅₀ + SV2 _pRRL的危险比为1.784 （**** P <0.0001）（图 8D）。最后，我们还评估了表达GA构建体以及SV2 _pRRL拯救构建体的细胞中运动神经元的纵向存活率。SV2 _pRRL共表达（危险比0.7769）再次挽救了GA ₅₀的明显毒性（危险比1.345 ）（**** P <0.0001）（图 8 E）。总的来说，这些发现表明，尽管在GA二肽存在下SV2减少，但以恢复正常SV2水平的方式进行干预足以恢复突触传递和突触信号传递事件并防止细胞死亡。

图8.补充SV2可以挽救GA诱导的突触功能障碍和细胞毒性

一种。在用eGFP-GA ₅₀转染48h后和用rSV2a-eGFP-pRRL慢病毒转导后48小时，皮层神经元上样了FM4-64染料。在通过含50mM KCl的ACSF灌注诱导去极化之前，监测基础荧光。图形表示是标准化为基础荧光（F）的荧光（ΔF）的变化ΔF/ F。显示了最后60秒的基线记录和60秒的去极化阶段。箭头指示开始去极化。在共表达rSV2a-eGFP-pRRL（橙色线）的情况下，将GA ₅₀表达（红线）缺乏突触释放的水平恢复到与eGFP对照（粉红色线）相当的水平。使用Sidak–Bonferroni方法确定统计学显着性，*** P <0.001，n = 4个生物学复制品中每一个的10个点状区域。

B．皮质神经元与mCherry或mCherry-GA ₅₀和GCaMP6f共转染，然后与rSV2a-eGFP-pRRL转导。从已识别的mCherry阳性神经元记录绿色荧光强度。在通过含50mM KCl的ACSF灌注诱导去极化之前，监测基础荧光。对ACSF灌注后的荧光峰值变化（ΔF）进行了定量化，归一化为基础荧光（F），即ΔF/ F。当共表达rSV2a-eGFP-pRRL时，GA ₅₀表达后观察到的Ca ²⁺流入量显着增加（* P <0.05）。数据表示为平均值±SEM。具有Sidak多重比较测试的单向方差分析，每个条件至少10个细胞，从n = 3个独立的生物学实验。在mCherry或mCherry + SV2条件之间未观察到显着差异。合并进行分析。

C–E。将神经元与mCherry-GAn质粒或单独的mCherry质粒共转染，并用rSV2a-eGFP-pRRL转导，然后每隔24小时成像一次。（C）对表达GA ₅₀或GA ₅₀ + SV2的皮质神经元进行Kaplan–Meier生存分析，进行了13天。SV2补充可以挽救由GA ₅₀诱导的明显细胞毒性。GA ₅₀的危险比为1.473，而GA ₅₀ + SV2的危险比降低至0.7227 。通过汇总n = 3个独立实验，对数秩Mantel–Cox检验，**** P评估每种条件下至少190个细胞 <0.0001。在eGFP或eGFP + SV2条件之间未观察到显着差异，将各组合并进行此分析作为对照。（D）对含有PR ₅₀和PR ₅₀ + SV2的细胞进行了Kaplan–Meier生存分析。在这些条件下，无论SV2水平升高如何，均会观察到明显的毒性，而PR ₅₀ + SV2（1.784）的细胞含有PR ₅₀的风险比（1.772）仍然很高。通过汇总n = 3个独立实验，对数秩Mantel–Cox检验，**** P评估每种条件下至少150个细胞 <0.0001。在eGFP或eGFP + SV2条件之间未观察到显着差异，将各组合并进行此分析作为对照。（E）对表达GA ₅₀或GA ₅₀ + SV2的运动神经元进行Kaplan–Meier生存分析，持续10天。SV2补充可以挽救由GA ₅₀诱导的明显细胞毒性。GA ₅₀的危险比为1.345，而GA ₅₀ + SV2的危险比则降至0.7769 。通过汇集n = 3个独立实验（对数秩Mantel-Cox检验，**** P <0.0001），评估每种条件下至少200个细胞。所有精确的P值均可在附录表S1中找到。

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转基因GA _149- CFP小鼠突触组件SV2特异性降低

在调查了GA表达对体外神经元功能的影响后，我们转向动物模型，确定是否在体内也发生类似的突触后果。正如我们前面所描述，我们的转基因小鼠表达了149重复GA二肽，耦合到青色荧光蛋白标签（GA ₁₄₉ -CFP）仅仅在脊髓，脑干神经元，和小脑深部核（Schludi等人，2017年）。这些区域中GA夹杂物的年龄依赖性积累会导致步态和平衡的进行性损伤，而运动神经元数量却没有减少，表明神经肌肉传递受到损害。

为了确定神经元GA表达对突触成分的影响，通过从这些动物的脊髓衍生的免疫印迹样品评估了SV2，突触素和PSD-95的水平。在20个月大的小鼠产生的全细胞裂解物中，分析显示与野生型对照相比，转基因动物中SV2蛋白显着降低（* P <0.05；图 9 A），而突触素和PSD-95的水平为没有显着改变（图 9 B和C）。成对的20个月龄野生型和转基因动物的石蜡包埋的脊髓颈段的免疫组织化学染色显示，ChAT染色或神经元DAPI形态学分析显示运动神经元数量没有差异（数据以平均值±SEM表示。t检验每组n = 4只动物；表 1）。此外，对20个月大小鼠队列中速冻后肢的切片进行了免疫组织化学染色。与野生型相比，在转基因GA ₁₄₉动物中观察到了接近神经肌肉接头的SV2水平的显着降低（图 10A）。突触蛋白SV2的评估和突触素在NMJ证实SV2的转基因动物中的特定减少与对照组相比（* P <0.05），而再次突触素水平未改变（图 10 B和C）。因此，从GA ₁₄₉动物衍生的组织中，我们已经在体内证实了在受影响的脊髓运动神经元细胞死亡之前，SV2蛋白的特异性降低。

图9.有症状的转基因GA149-CFP小鼠的脊髓裂解液中的SV2特异性降低

脊髓裂解物是从在Thy1启动子（Tgx GA ₁₄₉）下表达GA _149- CFP或野生型对照的20个月大小鼠的新鲜冷冻组织中产生的。

交流电。裂解液针对SV2（A），突触素（B）和PSD-95（C）进行免疫印迹。在转移之前，通过对Mini-PROTEAN TGX无污凝胶进行成像来确定总蛋白水平。归一化至总蛋白负载量的条带强度定量分析显示，与野生型动物相比，GA表达队列中的SV2蛋白水平显着降低，而突触素和PSD-95水平保持不变。数据表示为平均值±SEM。不成对t检验，* P <0.05。每组总共检查四只动物。确切的P值可在附录表S1中找到。

此图可在线获得源数据。

图9的源数据 [emmm201910722-sup-0004-SDataFig9.pdf]

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表1. 通过免疫细胞化学染色的运动神经元计数

	查⁺	DAPI ⁺
野生型	14.50±1.50	16.50±2.53
GA _149‐ CFP	14.25±1.37	15.38±1.00

图10.有症状的转基因GA _149- CFP小鼠的神经肌肉接头处的SV2特异性降低

从20个月大的GA ₁₄₉小鼠（Tgx GA ₁₄₉）或野生型对照的速冻组织切下肌肉切片（30μm）。进行免疫组织化学染色以评估邻近NMJ的突触蛋白水平。对切片进行SV2或突触素的免疫染色，并用神经丝复染色。

一种。左图：代表性图像显示，野生型动物（上）与GA ₁₄₉动物（下）中，α-真菌毒素阳性NMJ（红色）附近的SV2水平（绿色）。右图：代表性图像显示野生型动物（上）与GA ₁₄₉动物（下）中接近肌肉的突触末端的SV2水平（绿色）与神经丝（蓝色）重叠。

B，C。 SV2（B）或突触素（C）与神经丝共定位并归一化到神经丝区域的定量。该分析表明，与野生型相比，GA ₁₄₉动物的SV2水平显着降低，而突触素保持不变。数据表示为平均值±SEM。不成对t检验，* P <0.05。每组五只动物中的每只总共评估了10个肌肉的非重叠区域。确切的P值可在附录表S1中找到。

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讨论区

突触前运动神经元和突触后肌肉之间功能性交流的丧失是所有形式ALS的标志性特征，并已被提倡作为治疗干预的有希望的目标。在最近使用表达ALS引起TDP-43 _Q331K突变的小鼠模型的报告中，在7个月前描述了神经传递缺陷，形式为突触小泡融合和释放的缺陷，释放的可能性降低以及小泡的数量减少。运动神经元丢失（Chand等人，2018）。C9orf72中引起疾病的GGGGCC六核苷酸重复扩增也不例外。实际上，现在已经在模拟这种突变的范例中发现了早期突触缺陷，并被认为是潜在的可靶向疾病特征（Sareen等，2013； Devlin等，2015）。先前在两个独立的果蝇黑腹果蝇模型中的报道调查了表达30个或更多GGGGCC重复序列的果蝇中神经肌肉接头的结构特征。这些组都对C9orf72‐ALS突触病理学做出了宝贵的见解，因为这两个组均报告了活动区数量的显着减少（Freibaum等人，2015年; Zhang等人，2015）。重要的是，它们还显示出突触钮扣数显着减少（Freibaum等，2015），以及由于突触定量含量降低引起的诱发电位衰减（Zhang等，2015）。这些研究对于我们的理解至关重要，在飞行中表达的扩展GGGGCC重复序列的延伸结果可能来自重复序列扩增RNA，二肽重复序列蛋白（DPR）或两者的协同组合。在这项研究中，我们将重点放在了DPR介导的效应上。

与其他几个研究组一致，我们先前的发现表明甘氨酸-精氨酸（GR）和脯氨酸-精氨酸（PR）二肽对原代皮层和运动神经元具有快速而强烈的毒性（Mizielinska等，2014； Wen等，2014； Boeynaems等人，2016年）。在该模型中，当皮质神经元在表达后7天进行检查，运动神经元在表达后3天进行检查时，高达400个二肽重复序列的GA尚未引起神经元细胞死亡（Wen等，2014）。在我们驱动GA _149的转基因小鼠模型中从Thy-1启动子开始的CFP导致在脊髓和脑干中表达，我们观察到明显的运动功能障碍，与GA内含物负担增加有关，但缺乏运动神经元脱落（Schludi等人，2017）。这些结果令人感兴趣，因为研究GA在成熟神经元中的作用的工作表明树突状复杂性和细胞死亡减少（May等，2014）。此外，发表了第二个小鼠模型，该模型将GA ₅₀表达限制在皮质内。虽然该模型还会在6个月大时出现运动和认知行为缺陷，但同时也会发生神经元丢失和脑萎缩（Liu等人，2016年）。这些矛盾的发现以及运动缺陷和神经元功能障碍可能在神经元细胞死亡之前发生的可能性使我们彻底研究了体外成熟神经元中GA表达的细微差别，最终导致我们检查了突触传递和突触蛋白。

我们发现，除了胞质内含物外，GA聚集体还存在于神经区域内，并且不是固定的，而是以重复长度依赖的方式显示出不同程度的活动性。响应于诱发突触传递的刺激，功能分析显示，在表达GA的神经元中突触卸载明显减弱。通过研究可能发生这种情况的机制，我们发现含有GA聚集体的皮质和运动神经元均显示出Ca ^2+的显着增加在去极化条件下与对照神经元相比流入。探测突触蛋白的水平发现，突触囊泡相关蛋白2 SV2特异性降低。SV2的这种特异性降低在携带C9orf72 GGGGCC重复扩增的i3分化神经元中得到证实，表明这一发现将适用于携带C9orf72扩增介导的细胞毒性的全部补体的患者。虽然我们发现皮质和运动神经元最终确实会屈服于GA诱导的细胞死亡（但时间点超出了我们最初发表的评估（Wen等，2014年））），我们描述的突触变化发生在细胞死亡之前的几天。值得注意的是，当我们采用恢复表达GA的细胞中SV2水平的策略时，我们能够在功能上恢复突触释放，防止钙离子异常 ²⁺信号传导并挽救GA诱导的细胞毒性。最后，我们返回到体内模型，其中我们验证了对SV2水平特定降低的观察。尽管年龄已到20个月，但与年龄匹配的对照组相比，我们仍未观察到转基因GA _149- CFP小鼠的脊髓运动神经元数量减少。

在我们的模型中，SV2水平在体外和体内均降低。SV2，也称为突触小泡糖蛋白2，是在所有突触小泡中发现的必需成分（Feany等，1992）。除了在神经递质转运到突触小泡中的作用（Feany等人，1992）外，SV2还与Ca ^2+的几种介体有关（Feany等，1992）。调节和促进突触小泡融合事件信号传导的。Ca ²⁺传感器突触小分子1到突触小泡的适当内吞分选需要SV2 （Kaempf et al，2015），以及突触中适当的电压依赖性Ca ⁺²通道功能（Vogl et al，2015； Janz等，1999）。但是，在高频连续刺激下，这些动物的培养神经元显示出Ca ^2+的持续增加）。当降低SV2水平时会出现一个复杂的故事，因为不同的策略报告了对突触传递的不同影响。在SV2敲低的小鼠模型中，两个研究小组报告说，对低频刺激的反应仍然正常（Crowder等，1999依赖突触传递，这被认为可以解释观察到的癫痫行为表型（Janz等，1999）。相反，第三组报道了这些动物培养的海马神经元中单个诱发电位幅度的显着降低（Custer等，2006）。他们还继续证明了易于释放的突触囊泡池的减少以及释放概率的降低（Custer等， 2006）。SV2的基因缺失也导致自GABA能的中间神经元产生的自发抑制电位降低（Crowder等， 1999）。结合我们的发现，特别是证实SV2补充后，表达GA的神经元的突触功能和活力恢复的结果，我们在表达GA的神经元中观察到的SV2丢失是预防ACSF突触卸载的主要候选对象灌注刺激范例。体内，随着时间的流逝，逐渐减少的皮质和运动神经元适当释放的囊泡将对受体突触后细胞中产生的反应产生强烈影响。神经递质输入的这种减少可能导致整个皮质，脊髓以及神经肌肉接头处的信号传递进一步不正确。尽管我们不怀疑或不建议SV2的丧失是这些患者ALS的根本原因，但应将其视为导致C9orf72六核苷酸重复扩增，相关RNA病灶形成多因素异常环境的另一个因素和其他二肽重复蛋白变体。

细胞内Ca ^2+的水平在所有细胞中均受到严格调节，尤其是在神经元中（Zundorf＆Reiser，2011）。内部Ca ^2+的失调对许多基本细胞功能具有重大影响，因此已牵涉到多种神经退行性疾病中（Zundorf＆Reiser，2011）。例如，许多与阿尔茨海默氏病相关的突变和有毒的淀粉样β片段本身都可以独立地提高内部Ca ^2+的水平（Chakraborty和Stutzmann， 2011）。现在认为Ca ²⁺机能失调可能是AD发病机制中的早期触发事件之一，然后触发了病理信号转导级联反应（Chakraborty＆Stutzmann，2011）。当观察对旨在引起神经元放电的刺激反应中的Ca ²⁺流入时，我们发现与对照细胞相比，含有GA二肽的皮质和运动神经元显示出明显更强的反应。尽管我们尚未确定机制，但我们已经考虑了导致这种结果的几种可能性。GA聚集体可能直接影响细胞膜通透性，或通过与Ca ^2+的相互作用间接改变通透性通道时。另一种可能性是，这是细胞的前馈机制，可解决突触小泡成分蛋白的丢失。由于有效的突触小泡融合需要Ca ²⁺（Schneggenburger＆Rosenmund，2015），如果突触小泡释放受到损害，则较高的Ca ^2+内流可能构成神经元已经存在的反馈补偿机制，从而增加了神经元发生突触的可能性。成功释放那些囊泡。最后，如上所述，Ca ²⁺水平的扰动可能是神经突中GA聚集体导致SV2水平改变的直接副作用。SV2与Ca ²⁺转运蛋白和Ca的相互作用减弱 ^2+的减弱突触小泡融合所需的传感器可能对Ca ²⁺进入和突触中的信号传导具有重大影响。尽管我们已经提供了恢复SV2水平减轻神经元刺激后增加的Ca ^2+内流的证据，但我们尚未分离出SV2水平的这些波动有助于我们关于模型中细胞Ca ²⁺进入的观察结果的机制。Ca ²⁺稳态的恢复已被提议作为神经退行性疾病的治疗策略，我们的数据表明，C9orf72‐ALS / FTD患者也可能受益于细胞Ca ^2+的恢复规。确定这种情况的发生方式和原因，将是对GA介导的突触传递缺陷的可能治疗干预措施的宝贵见解。

由于DPR在C9orf72‐ALS / FTD的机制贡献方面的相关性，人们普遍提出了担忧，这归因于DPR在神经元细胞死亡之前在大脑和脊髓中的分布广泛且分布广泛（Mackenzie等，2013；2015； Gomez-Deza等人，2015年）。我们的发现表明，含有GA的聚集体可以在神经区域内发现，并影响突触传递和突触小泡的组成。我们的数据表明，到48小时，表达GA肽的神经元显示出Ca的这种异常升高 ^2+的大量涌入，SV2水平降低以及突触卸载被取消。在以后的研究中，详细说明这些事件发生的顺序将确定所涉及的机制，并为预防所致下游突触功能障碍的靶向方法提供见识。我们怀疑在明显丧失运动神经元之前功能性突触信号的破坏是在我们的GA ₁₄₉小鼠模型中观察到的行为表型的罪魁祸首。在人类C9orf72患者的多个病例中，死后组织样本的染色显示神经元中含有带有营养不良性神经突的GA二肽聚集体（Vatsavayai等人，2016 ; Sakae等人，2018）。最近的一篇文章进一步巩固了GA的潜在致病性以及在C9orf72 ALS / FTD中靶向这种二肽的治疗价值。在这项研究中，在C9orf72‐ALS / FTD小鼠模型中施用GA靶向抗体可成功减轻神经变性，改善行为预后并提高生存率（Nguyen等，2020）。在人类患者中，我们无法确定各种C9orf72提出的致病机制的作用，但是连同最近发表的这项工作，我们的体外和体内研究无疑为GA可能具有突触后果的想法提供了进一步的可信度，这些后果可能具有治疗性有针对性的。

总体而言，我们在了解GA DPR聚集体的存在如何导致脊髓运动神经元死亡之前可能导致行为运动缺陷方面取得了一些进展。此外，这些发现有助于更好地阐明先前关于GA是否对神经元有毒性的矛盾报道（May等，2014； Wen等，2014； Zhang等，2014）。）。我们建议，随着时间的推移，由于GA神经内含物逐渐导致突触传递异常，从而导致神经元的逐渐毒性。这个概念还将开始解释C9orf72‐ALS / FTD患者的脑和脊髓中DPR尤其是GA的广泛分布与疾病的严重程度或神经元脱落最严重的区域无关（Mackenzie等人，2013年；戴维森等人，2014年，2016年；坚德隆等人，2015年；戈麦斯·德扎等人，2015年；施卢迪等人，2015年）。最近还确定了包括GA在内的DPR可以在细胞之间传递（Chang等，2016； Westergard等，2016）。在这里，我们已经证明，GA夹杂物在细胞死亡之前的某个时间点存在于神经突中并在其中移动，这将为细胞间的传播事件留出足够的时间。在体内，这种长期细胞间扩散的结果将是受影响组织的无处不在，随着时间的推移，其突触传递能力将逐渐降低。

材料和方法

试剂种类

抗体

Abcam：抗MAP2（Abcam Cat＃ab5392，RRID：AB_2138153），抗神经丝重（Abcam Cat＃ab8135，RRID：AB_306298），抗PSD‐95（Abcam Cat＃ab18258，RRID：AB_444362），抗SV2 （Abcam目录号ab32942，RRID：AB_778192）; Covance：anti-SMI32（Covance Research Products Inc，产品目录号SMI-32R-100，RRID：AB_509997）；DSHB：抗SV2（DSHB Cat＃SV2，RRID：AB_2315387）; GeneTex：抗p62 / SQSTM-1（GeneTex目录号GTX100685，RRID：AB_2038029）; 密理博（Millipore）：抗ChAT（密理博目录＃AB144P，RRID：AB_2079751）; Thermofisher：抗突触素（Thermo Fisher Scientific Cat＃MA5-16402，RRID：AB_2537921）。

结构体

参考文献中先前对使用的eGFP‐GA _n构建体进行了表征。Wen等（2014）。从这些载体中亚克隆了mCherry‐GA _n构建体。pGP-CMV-GCaMP6f是Douglas Kim博士的礼物（Addgene质粒＃40755; Chen等，2013）。rSV2a-eGFP-pRRL是Sandra Bajjalieh博士的慷慨礼物。

其他试剂

安捷伦：达科靶抗原回收解决方案；美国生物：脱脂奶粉全脂饼干；伯乐实验室：4–20％Mini-PROTEAN TGX无污染凝胶，广谱分子量阶梯，Tris /甘氨酸运行缓冲液，Tris /甘氨酸转移缓冲液；Decon Laboratories Inc：乙醇；电子显微镜科学：16％低聚甲醛，Citifluor AF3；LI‐COR Biosciences：IRDye 680 RD驴抗兔IgG，IRDye 680RD山羊抗小鼠IgG，IRDye 800CW驴抗小鼠IgG，IRDye 800CW山羊抗兔IgG；Millipore Sigma：β-巯基乙醇，牛血清白蛋白（BSA），Bradford试剂，二水氯化钙，脱氧胆酸，二硫苏糖醇（DTT），（乙二腈）四乙酸（EDTA），D-葡萄糖，HEPES，过氧化氢，的Immobilon-FL膜，聚d赖氨酸，六水合氯化镁，OptiPrep密度梯度介质，十二烷基硫酸钠，磷酸钠;国家诊断：组织清除；Takara Bio USA：Lenti‐X包装单发，Lenti‐X浓缩器，Lenti‐X Gostix；Thermofisher：AlexaFluor546联结的抗小鼠或抗兔二抗，AlexaFluor647连接的抗小鼠或抗兔二抗，α-甲苯毒素AlexaFluor594连接物，B27补充剂，二mid基-2-苯基甲苯酸酯吲哚（DAPI），FM4-64荧光染料，谷氨酰胺，热灭活的马血清，Hoechst 33258五水合物（双苯甲酰胺），层粘连蛋白，Lipofectamine 2000试剂，LysoTracker深红色，甲醇，MitoTracker深红色FM染料，神经基础培养基，中性亲和素蛋白，正常山羊血清，磷酸盐缓冲液盐水（PBS），氯化钾，蛋白酶抑制剂，碳酸氢钠，氯化钠，SYTO RNASelect绿色荧光细胞染色剂，Tris–HCl，Triton X-100，胰蛋白酶，吐温20；美国生物学：Nonidet（NP-40）；媒介实验室：具有DAPI的Vectashield Antifade安装介质。

该原代皮层和运动神经元培养

所有实验均根据托马斯·杰斐逊大学的机构动物护理和使用委员会提出的准则进行。如先前所述（Kayser等，2006 ; Hanamura等，2017），从胚胎第18天的大鼠中分离出原代大鼠皮层神经元。从Charles River购买定时怀孕的雌性Sprague Dawley大鼠，并在胚胎解剖当天将其分娩。到达后立即转移到实验室。将解离的皮层神经细胞悬浮液涂在带有D赖氨酸涂层的盖玻片或带有玻璃底中心的35 mm皿中，置于Neurobasal培养基中，在37°C和5％CO _2的条件下添加B27。。从胚胎的第14.5天脊髓制备原代大鼠运动神经元，并对已建立的实验方案稍作修改（Magrane等，2012）。第二天早晨，解剖胚胎脊髓并机械破碎成小块，然后与0.025％胰蛋白酶一起孵育。手动研磨后，将细胞通过4％（w / v）的牛血清白蛋白（BSA）缓冲垫，然后在不制动的情况下通过10.4％（v / v）Optiprep缓冲垫（Sigma）离心55分钟。然后通过2个连续的4％（w / v）BSA缓冲垫旋转收集的运动神经元带。将细胞重悬于含有B27补充剂，谷氨酰胺（0.25％），β-巯基乙醇（0.1％）和马血清（2％）的Neurobasal培养基中。解离的运动神经元铺在聚d赖氨酸和层粘连蛋白涂层的盖玻片或带有玻璃底中心的35毫米培养皿，并在5％CO _2的情况下保持在37°C 。按照IACUC批准的方案，将动物圈养在Bluemle生命科学动物设施中，并在标准笼子中随意取食。

神经元转染

如先前报道（Wen等，2014），用编码不同长度的GA的质粒或对照eGFP-FLAG进行原代皮层和运动神经元转染。对于需要使用488 FITC通道评估Ca ²⁺水平的GCaMP实验，使用标准亚克隆技术将eGFP标签转换为mCherry。为了表示功能成熟的神经元，我们在原神经元文化能够进行兴奋性突触通讯的时间点开始了所有实验。通过DIV7，源自大鼠的皮质神经元培养物表达了NMDA和AMPA受体亚基的完整互补物（Janssens＆Lesage，2001年）），并且通过DIV9，我们已经检查了神经元功能的时间点在功能上适合突触传递（Virdee et al，2017）。同样，已经证明原代大鼠运动神经元在DIV7时经历了强烈的谷氨酸诱导的兴奋性毒性，这是我们在DIV5开始运动神经元实验并在DIV7进行评估的基础（Vincent等，2004）。通过使用Lipofectamine 2000试剂和1μg总DNA /孔，可以完成DIV7皮质神经元和DIV5运动神经元的转染。当需要进行共转染时，分别以所需的eGFP或mCherry GA构建体以1：4 cDNA比率引入Td-Tomato或GCaMP6f。

i3皮质神经元培养

来自iPSC的皮质神经元是通过转录因子介导的分化产生的，该技术被称为i3神经元（整合，诱导和同基因）。利用了两个细胞系，它们来自具有C9orf72重复序列扩增的患者，以及同基因对照，其中从患者细胞系中去除了重复序列。这些是来自Michael E. Ward博士和Kevin Talbot博士的好礼物。在捐献组织和产生多能干细胞之前，已从C9orf72 ALS患者获得知情同意。收集的组织符合《赫尔辛基WMA宣言》和《卫生与公众服务部贝尔蒙特报告》中规定的原则。在iPS阶段，将细胞保留在基质胶包被的平板（Corning）上的Essential 8 Flex培养基（Gibco）中。等人（2018），其中主神经元转录调节因子Neurogenin-2（NGN2）在强力霉素诱导型启动子的控制下稳定整合到iPS系的安全港基因座中。为了将iPS细胞分化为皮质神经元，将细胞解离为单个细胞，然后在诱导培养基（DMEM / F12，N2，NEAA和l谷氨酰胺）含有2 mg / ml强力霉素。将细胞用强力霉素处理3天，然后解离并铺在PLO包被的平板上。然后让细胞在由添加了BDNF，NT-3和层粘连蛋白的BrainPhys培养基（STEMCELL）组成的皮质成熟培养基中再培养18天，每周两次更换一半培养基。分化后21天收获细胞或固定细胞。

iMN裂解物

iMNs细胞沉淀是来自Answer ALS联盟的慷慨礼物。iMNs是由对照和C9orf72‐ALS患者产生的，并根据Neurolincs（http://neurolincs.org/technologies/）制定的协议进行生长和分化。在组织捐赠和多能干细胞生成之前，必须从所有联合体参与者处获得知情同意。组织收集协议符合《赫尔辛基WMA宣言》和卫生与公共服务部Belmont报告中规定的原则。所使用的脊髓神经元协议可重复生成混合神经元种群，其中包括20-30％Islet1阳性神经元。分化32天后，将iMN用PBS冲洗，用细胞刮刀刮擦，然后通过1000 g离心沉淀 5分钟吸出上清液；沉淀在液氮中速冻，并储存在-80°C下。在我们手中，将这些细胞重悬于RIPA缓冲液中，并按照所述方法进行免疫印迹。

免疫细胞化学

将玻璃盖玻片上的原代神经元培养物在4％多聚甲醛中固定8分钟。在室温下将细胞在含5％BSA和0.1％Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中渗透和封闭1 h，在4°C下与一抗孵育过夜，在室温下与二抗孵育1 h 。将盖玻片固定在带有DAPI（矢量实验室）的Vectashield Antifade安装介质中的载玻片上，以染色细胞核。每个步骤之间发生了3次PBS洗涤。使用了以下一级抗体：抗SMI32（Covance Research Products Inc目录号SMI-32R-100，RRID：AB_509997，1：1,000），抗MAP2（Abcam目录号ab5392，RRID：AB_2138153，1：5,000），抗神经丝重（Abcam Cat＃ab8135，RRID：AB_306298，1：1,000），抗SV2（DSHB Cat＃SV2，RRID：AB_2315387，1：200），抗突触素（Invitrogen SP11，Thermo Fisher Scientific Cat＃MA5-16402，RRID：AB_2537921、1：200），抗PSD‐95（Abcam Cat＃ab18258，RRID：AB_444362、1：1,000）和抗p62 / SQSTM-1（GeneTex Cat＃ GTX100685，RRID：AB_2038029，1：1,000）。以1：500稀释度使用的二抗是AlexaFluor546或AlexaFluor647偶联的。共聚焦显微镜用于捕获图像（奥林巴斯FV1000）。对于每个视野，以1μm的步长获取10张图像，并将其投影到单个z堆栈图像。每个盖玻片产生了十个不重叠的区域，用于需要定量分析的实验。对于所有基于显微镜的成像，每个实验的激光和滤光片设置均根据内部实验对照组（即eGFP或表达mCherry的细胞）进行校准，以说明生物学差异并确保可重复性。

突触蛋白点和神经突长度的评估

GA _n被转染到神经元中。转染后48小时，对神经元的突触成分蛋白SV2，突触素或PSD-95进行免疫染色，用神经丝和DAPI复染，并通过共聚焦显微镜成像。使用NIH ImageJ软件（V1.50i，Bethesda，MD）对沿eGFP ⁺细胞中神经突的每个上述突触成分的点进行定量。在视觉上基于在神经丝区域内的定位以及将它们与相邻点分开的不同边界，在z堆栈投影图像上分配了点。为了确定神经突的总长度，使用ImageJ的NeuronJ插件功能对图像进行了分析。在eGFP ⁺ 细胞，每个神经突被单独追踪，每个细胞的长度总和用于分析。

活细胞聚集体，线粒体，溶酶体和总RNA转运

GA _n表达后48小时，神经元进行了活细胞成像。使用高分辨率共聚焦显微镜快速捕获图像，以评估单个GA聚集体，线粒体，溶酶体和RNA的速度。GA _ñ通过使用488nm激光观察到聚集体。MitoTracker深红色FM染料（分子探针，50 nM）标记的线粒体。这种可透过细胞的化合物的最大激发波长为644 nm，可通过637 nm激光进行可视化。拍摄明场图像以定义神经突束。图像以2秒的间隔拍摄5分钟。LysoTracker深红色（Molecular Probes，50 nM）和SYTO RNASelect Green荧光细胞染色剂（Molecular Probes，500 nM）分别标记了溶酶体和总RNA，但在与MitoTracker相同的原理下使用相同的成像参数进行操作。LysoTracker的最大激发波长为647 nm，仍然可以通过637激光进行可视化，而SYTO RNASelect在490 nm处具有峰值激发，从而将使用切换为488激光，并要求使用基于mCherry的GA构建体进行转染。GA的各个速度使用ImageJ软件通过动态图分析功能确定_n聚集体，线粒体，溶酶体和总RNA。

SV2 mRNA信标

通过Bio-Synthesis，Inc.获得了针对SV2 mRNA的特异性探针，其序列为5'[Cy5] GAACCAGGTGGTGACTGTTTA [BHQ-2] 3'。将其以100μM重悬于TE缓冲液（pH 8.0）中，并分装使用。转染前一天，将2.7μl中性亲和素溶液添加到9μl体积的信标中，并在避光的室温下孵育1.5小时，然后移至4°C过夜。然后添加此溶液以及eGFP或eGFP-GA50的正常转染成分，以及共转染的td-Tomato细胞填充质粒。表达2天后，使用共聚焦成像评估信标和GA细胞定位。

突触小泡释放

使用TRITC成像参数通过应用FM4-64荧光染料（Invitrogen）来测量囊泡胞吐作用（Gaffield＆Betz，2006 ; Verstreken等，2008）。在eGFP‐GA _n表达48小时后，将神经元与10μMFM4-64染料在高K ⁺ ACSF中孵育，然后在低K ⁺ ACSF中洗涤以恢复基线。高K ⁺ ACSF（ACSF刺激物：95 mM NaCl，50 mM KCl，5 mM碳酸氢钠，1.2 mM磷酸钠，1 mM MgCl ₂六水合物，10 mM葡萄糖，10 mM HEPES和1.33 mM CaCl ₂二水合物）促进神经元放电和通过囊泡回收吸收染料。低介电⁺ACSF（140 mM NaCl，5 mM KCl，5 mM碳酸氢钠，1.2 mM磷酸钠，1 mM MgCl ₂六水合物，10 mM葡萄糖和10 mM HEPES）可恢复细胞并使其标准化至基线。使用我们的Nikon Eclipse T i显微镜，鉴定出eGFP ⁺细胞，然后在TRITC通道上以40倍的放大倍数采集基线测量值3分钟，并每秒捕获一次图像。通过用ACSF Stim灌注刺激细胞，并在2分钟内每秒捕获一次图像。信号归一化到平均基线记录可以解释染料负载量的任何初始变化。从每个eGFP ⁺中选择了十个FM4-64点状区域使用NIS-Elements Imaging软件进行神经元分析。动力学表示为归一化为基础荧光（F）的荧光变化（ΔF），ΔF/ F，作为刺激染料释放的指标。

神经元Ca ²⁺成像

神经元与mCherry-GA _n构建体和pGP-CMV-GCaMP6f共转染（来自Douglas Kim的礼物; Addgene质粒＃40755; Chen等，2013）。48小时后，鉴定出mCherry ⁺细胞，并将细胞切换至不含pH指示剂染料的低钾人工脑脊液（ACSF Low-K ⁺），以进行实时成像。在使用或不使用CaCl _2的ACSF Stim诱导神经元去极化之前，监测3分钟的基础GCaMP荧光强度（FITC通道）。Ca ^2+内流的贡献是通过在含高KCl但不含Ca ^2+的ACSF中进行刺激来确定的。以250倍的间隔以40倍的放大倍率捕获图像。在开始ACSF灌注后，影像学又进行了3分钟。使用NIS-Elements Imaging软件，可以产生细胞体的ROI，并在整个成像过程中生成荧光值。基线归一化后，记录每个mCherry ⁺神经元细胞体的荧光ΔF/ F峰值变化。

纵向活细胞成像生存分析

如前所述，将与eGFP‐GA _n和td‐Tomato质粒共转染的皮质和运动神经元进行了纵向活细胞成像，以对多达400次重复的多GA片段进行存活和死亡风险分析（Wen等人，2014年）。借助我们使用尼康Eclipse Ti显微镜和CoolSNAP ES2高性能CCD相机的全自动显微镜系统，载物台和快门的移动，聚焦和图像采集均由NIS-Elements Imaging软件（尼康）控制。该系统可以每隔24小时对每组的数百个神经元进行成像。Td-番茄荧光被用作细胞存活的标志物，因为质膜破裂引起的荧光损失表明细胞死亡。在皮质神经元中监测eGFP和Td-番茄信号13天，在运动神经元中监测10天。目视检查从自动成像协议生成的文件可以评估单个神经元随时间的存活，死亡定义为神经元丢失td-Tomato荧光的那一天。

定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）

使用定量逆转录-聚合酶链反应（qRT-PCR）量化了分化后21天的i3皮质神经元培养物中SV2的表达，以及经过rSV2a-eGFP-pRRL慢病毒表达的SV2上调后4天皮质神经元的表达。用Trizol提取mRNA，并通过Invitrogen Superscript First-strand试剂盒将500 ng RNA转化为cDNA。使用PowerUp SYBR Green进行定量PCR。对于每个实验，从i ³培养物的每种基因型的三个独立分化的孔和皮质神经元组的三个独立处理的孔中一式三份地测量样品。使用GAPDH水平数据归一化并分析根据ΔΔ Ç _Ť方法。列出了从Integrated DNA Technologies（Coralville，IA）获得的每个基因的引物对。适用于i ³人的引物：SV2正向：CTG CTC CCA GTG ATG GTT ATT，SV2反向：GAT CTC ATC ATC CTC GTC ATGG。用于大鼠皮层神经元的引物：SV2正向：GAA CCA GGT GGT GAC TGT TTA，SV2反向：TCC AGC AAC GGA ATG ATG AG。GAPDH的引物可以跨物种使用，并且都用于两个实验组。GAPDH正向：AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG，GAPDH反向：TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGTCA。

rSV2a-eGFP-pRRL慢病毒的生产

我们从华盛顿大学Bajjalieh实验室获得了rSV2a‐eGFP‐pRRL慢病毒构建体作为慷慨的礼物，该实验室产生了带有eGFP标签的大鼠SV2（Schivell等，1996； Yao等，2010）。）。根据制造商的协议，我们在内部通过Lenti-X包装单次注射生成了慢病毒颗粒，并使用Lenti-X浓缩器（Takara Bio）进行了浓缩。慢病毒GoStix确定了有效的病毒生产。每500μl细胞培养基中加入1μl病毒。在成熟皮层神经元中表达4天后，通过qPCR和免疫印迹分析确定了慢病毒转导的神经元与未处理的神经元相比有效的SV2上调。然后，将这种有效病毒以指定的基于体积的比率用于所有救援实验。转染方案完成后，总是立即添加病毒以表达GA构建体。

小鼠组织的免疫印迹和免疫组化

所有动物实验规程均根据欧洲和德国关于动物使用的国家指南进行，并得到政府委员会（德国RegierungspräsidiumOberbayern）的批准。

免疫印迹

用20个月大的GA ₁₄₉ CFP和C57BL / 6N背景的野生型小鼠制备新鲜冷冻的脊髓，这些小鼠先前已经过验证和表征（Schludi et al，2017）。将小鼠关在标准笼子中，在无病原体的设施中，昼夜照明时间为12小时。使动物自由获得食物和水。所有实验均根据托马斯·杰斐逊大学的机构动物护理和使用委员会提出的准则进行。通过在含10 mM HEPES pH 7.9、1.5 mM MgCl _2的缓冲液中匀浆来制备解离的单细胞悬液，10 mM KCl，0.5 mM DTT和1：100蛋白酶抑制剂混合物，然后在845 g于4°C离心5分钟。将细胞重悬于RIPA缓冲液（150 mM NaCl，1％Nonidet（NP-40），0.5％脱氧胆酸，0.1％十二烷基硫酸钠，50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA和1：100蛋白酶抑制剂混合物）中，脉冲超声处理3次，每次10 s，两轮之间在冰上停留2分钟，然后以21,130 g旋转在4°C下30分钟。通过Bradford方法测定上清液级分的蛋白质浓度。将5μg蛋白质和宽谱分子量梯加载到4–20％的Mini-PROTEAN TGX无污凝胶上进行电泳分离。分离后，使用预设的无污染凝胶参数，通过Bio-Rad ChemiDoc触摸成像系统评估总蛋白水平。将蛋白质转移到Immobilon-FL膜（Millipore）上，并在室温下用0.1％Tween-20（PBST）和5％牛奶在PBS中封闭30分钟。将膜与第一抗体在PBST + 5％牛奶中于4°C孵育过夜。使用了以下一级抗体：抗SV2（Abcam ab32942，Abcam Cat＃ab32942，RRID：AB_778192，1：1,000），抗突触素（Thermo Fisher Scientific Cat＃MA5-16402，RRID：AB_2537921，1：1,000），和anti-PSD‐95（Abcam目录号ab18258，RRID：AB_444362，1：1,000）。PBST洗涤后，将膜与抗原特异性荧光探针结合的二抗（1：15,000稀释的LiCor二级抗体）在PBST + 5％牛奶中于室温孵育1小时。使用Odyssey红外成像系统（LiCor）和ImageStudio软件对膜进行可视化。使用ImageJ，在与每种目标蛋白质的分子量相对应的高度指定目标条带。分析这些选择以确定每个泳道的像素强度。为了标准化结果，选择了Bio-Rad无染色凝胶总蛋白图像的水平截面，其分子量范围很广。确定每个车道的总体强度，允许归一化而不会偏向单个代表性的负载控制，并考虑了组织裂解液提取物的可变性。来自poly-GA的四只动物评估了_149个CFP和野生动物群。对于这些队列中的每一个，两只动物是雄性，两只是雌性。

免疫组织化学

按照批准的方案进行安乐死后，对20个月大的小鼠进行1％无菌PBS的心内灌注。解剖脊髓组织福尔马林固定2天，石蜡包埋。染色是在载玻片上进行的，这些载玻片包含从这些组织样本的宫颈和上胸部区域切下的10微米厚的切片。将载玻片加热至55°C过夜，在Histoclear中脱蜡，然后依次进行100％，95％，90％和70％乙醇洗涤以重新水化。通过在3％的过氧化氢的甲醇溶液中孵育30分钟来封闭内源性过氧化物酶的活性。通过在柠檬酸盐靶抗原回收溶液中于95°C孵育1 h来实现抗原的暴露。在室温下，将切片在PBS中的10％正常山羊血清中封闭1小时。将载玻片与抗ChAT的一抗（Millipore Cat＃AB144P，RRID：AB_2079751，1：1,000）在4°C孵育过夜，并用AlexaFluor546进行二级标记以进行运动神经元特异性染色。Hoechst用于染色核。将幻灯片安装在Citifluor AF3和Nikon A1中⁺带有NIS-Elements Imaging软件的显微镜用于图像捕获和处理。运动神经元计数是通过使用ImageJ软件手动计数运动神经元/前角获得的。使用双侧前角图像并计算ChAT ⁺细胞以及适当大小和形状的运动神经元Hoechst核，为每只实验动物的每个前角运动神经元的数量。来自GA _149的四只20个月大的动物对CFP和野生型队列进行了评估。后肢在液氮中速冻并储存在-80°C下。在载玻片上进行NMJ染色，载玻片包含从这些样品切下来的30μM厚切片。将载玻片加热至55°C过夜，在Histoclear中脱蜡，并依次进行100％，95％，90％和70％乙醇洗涤。在室温下，将切片在PBS中的10％正常山羊血清中封闭1小时。将载玻片与抗SV2（DSHB Cat＃SV2，RRID：AB_2315387，1：200）或抗突触素（Invitrogen SP11，Thermo Fisher Scientific Cat＃MA5-16402，RRID：AB_2537921， 1：200）和抗神经丝重（Abcam目录号ab8135，RRID：AB_306298，1：1,000），并使用AlexaFluor辅助标签。Hoechst用于染色核。α-真菌毒素AlexaFluor594共轭物用于标记神经肌肉接头。像对脊髓切片一样进行载玻片的安装和成像。来自两个GA的五只20个月大的动物_对149个CFP和野生型队列进行了评估，对进行基因分析的人员进行了分析。对于这些队列中的每一个，两只动物是雄性，三只是雌性。

统计分析

所有统计分析均使用Prism 8.0软件（GraphPad）进行。通过对数秩检验评估了Kaplan–Meier生存曲线之间的差异，还进行了危险比评估，以评估所选条件之间的直接比较。使用Sidak–Bonferroni方法完成了突触卸载实验中每个时间点的成对评估的统计学意义。在指明的地方进行了采用事后Dunnett多重比较检验的单向方差分析，采用未经校正的Fisher的LSD检验的单向方差分析以及采用Welch校正的未经配对的t检验。所有数据均以平均值±SEM表示，P <0.05视为显着。

资料可用性

在这项研究中没有产生大规模的数据集。

致谢

我们感谢Dalva博士的实验室为皮质神经元制剂提供胚胎大鼠皮质。我们感谢博士。Michael E. Ward和Kevin Talbot分享了i3 iPS细胞系，Jeffrey D. Rothstein博士和Answer ALS协会为我们提供了诱导的MN的全细胞沉淀，Sandra Bajjalieh博士慷慨地分享了rSV2a- eGFP‐pRRL慢病毒质粒。我们还要感谢Jefferson Weinberg ALS中心的成员对这项工作的建议和严格的评估。这项工作得到了美国国立卫生研究院（RF1-AG057882-01和R21-NS0103118至DT，R01-NS062047至LM和R00 NS091486至ARH），肌肉营养不良协会（DT），罗伯特·帕卡德ALS研究中心的资助（DT），Family Strong 4 ALS基金会和Farber Family Foundation（BKJ和PP）。

作者贡献

概念化：BKJ，DT；方法：BKJ，KJM，KAR，AB，BMC，KK，LM；调查：BKJ；KAR，AB，BMC；形式分析：BKJ；可视化：BKJ，DT；写作-原始草案：BKJ，DE，DT；资金获取：ARH，PP，DT；资源：MHS，TW，XW；监督：ARH，PP，DT。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突。

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支持信息

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SV2补给可缓解C9orf72‐ALS / FTD中甘氨酸丙氨酸二肽诱导的突触功能障碍| EMBO分子医学