如何用少量临床样本发9分顶刊
Transcriptional profiling identifies an androgen receptor activity-low, stemness program associated with enzalutamide resistance转录谱分析揭示雄激素受体活性低，细胞干性与抗恩杂鲁胺治疗有关
一、 研究背景
雄激素受体(AR)拮抗剂恩杂鲁胺enzalutamide是转移性去势抵抗性前列腺癌(CRPC)的主要治疗方法之一。但是并非所有患者均有应答，且恩杂鲁胺原发(de novo)耐药机制尚不清楚。已有研究证明细胞干性，神经源性基因表达与获得性抵抗AR靶向治疗和前列腺癌的侵袭有关，而转录谱分析可以确定特定的基因组差异，包括那些与AR转录活性降低和干性有关的基因组，有助于阐明恩杂鲁胺原发耐药机制。
二、 分析流程
三、 结果解读
1.患者特征与临床结果
该研究纳入了36例先前未接受恩杂鲁胺，阿比特龙或多西他赛治疗的转移性CRPC患者。在研究期间，受试者接受恩杂鲁胺治疗，每12周评估一次临床或影像学肿瘤进展。确定所需样本数量时，因为独立性和正态性的假设不成立而无法采用传统的功效分析，作者使用了inverse power law去表征分类误差，error = a×n-α + b，error是n个训练样本时的预期错误率，a是learning rate，α是decay rate，b是贝叶斯误差(最小误差)，当a = 0.736，α= 0.65和b= 0.001时，可以估计样本大小的误差。因此，考虑到活检失败率为20％，作者估计需要招募36名患者，才能产生30名可评估肿瘤的患者（20名有反应者和10名无反应者，先前的文献表明在相似的患者中，恩杂鲁胺对PSA的应答率约为70％），而30名患者的错误率约为0.08（0.08≈0.736×30-0.65+0.001）。最后有34例患者(表1)可评估前列腺特异性抗原（PSA）来判断对恩杂鲁胺的反应，有9位无反应者（12周时PSA下降<50％）和25位反应者（12周PSA下降≥50％）(图1)。
表1.34例患者基线特征
图1.PSA瀑布图
根据实体瘤的疗效评价标准(RECIST)，有38％（13例）患者经放射影像鉴定为有反应，这13例在PSA50反应者(图1)均可见有反应。与反应者相比，无反应者的TOT中位数显著缩短（3.4 vs. 24.2 个月，P <0.001，HR= 4.90），PFS（3.67 vs. 24 个月，P <0.001，HR= 5.51）和OS（15.97vs. 36.6 个月，P <0.001，HR = 4.41）也显著缩短。（图2）
图2.按PSA分类的反应者分层KM生存分析
2.靶向DNA测序
接下来作者分析了患者之间的基因组差异，26位患者可进行靶向DNA测序（DNA-seq），其中有5位是无反应者，21位是反应者。作者研究了先前已有报道与预后不良或抗AR靶向疗法有关的基因(TP53，RB1和PTEN)，对于这三个基因（图3）和其它有关的基因来说，可能因样本量太少，反应者与无反应者之间均未检测到统计学上的显著差异，但是无反应者中TP53突变的可能性更大。（Fisher’s exact test P = 0.055）
图3.TP53，PTEN和RB1的DNA-seq结果
3.评估AR基因组突变和表达
因为AR是enzalutamide的靶标，因此作者接下来使用DNA-seq确定各组之间是否存在AR基因组差异。在具有AR的DNA序列数据的22位患者中，有3位无反应者和19位反应者。在这两组之间，AR基因组改变没有统计学显著差异（图4.A）。接下来，作者将肿瘤样本冷冻在最佳切割温度（OCT）培养基中，并进行激光捕获显微切割，通过RSEM软件基于GRCh37 GENCODE version 19（Ensembl 74）基因注释，得出基因表达测量结果的原始read counts和每千百万转录本（TPM）。为了滤除低表达的基因，要求基因中至少3个样品中的TPM大于1。在7位无反应者和18位反应者的RNA-seq中比较了AR mRNA表达，结果显示两组之间的AR mRNA表达相似（图4.B）。此外，两组的转录变体(transcript variant)AR-V7表达也相似（图4.C）。
接下来作者使用了AR [C6F11] XP兔单克隆抗体对22例患者进行AR免疫组化，有6个无反应者和15个反应者，肿瘤中均存在明显的核AR染色（图4.D）。因此作者得出结论，AR基因突变情况与AR表达改变均与原发enzalutamide抗药性无关。
图4.AR DNA-seq结果和表达状态
4.通路分析与AR活性评估
接下来，作者试图确定RNA-Seq数据中无反应者与反应者之间是否存在差异激活的通路。将经过DESeq2的varianceStabilizingTransformation的表达数据输入GESA进行分析，根据GESA的默认算法signal2noise计算差异表达。基于（FDR）q-value=0.05，确定了无反应者与反应者中18个显著差异的途径（图5.A）。在无反应者中，上皮间充质转化富集分数最高，此外与EMT相关的其他途径也被激活，包括IL-6 / Jak / Stat3信号传导，TGF-β信号传导和通过NFκB的TNFα信号传导。此外，免疫标记途径也在无反应者中被激活，包括IFN-α，IFN-γ，同种异体移植排斥，炎症反应和补体途径。
虽然结果没有显示AR信号是差异激活的基因集，但是无反应者中与EMT，干性和免疫标志有关的基因集被激活，在作者先前的研究中这些基因集在AR活性低的局部激素治疗的前列腺癌亚组中也被激活。重要的是，先前研究中的低AR活性与较短的无转移生存时间或复发时间有关。因此，作者接下来使用Spratt评分从样本的RNA-seq数据中评估了AR活性，Spratt AR活性评分为先前研究中的九种典型AR转录靶基因（KLK3，KLK2，FKBP5，STEAP1，STEAP2，PPAP2A，RAB3B，ACSL3和NKX3-1)的加权线性总和。与反应者相比，无反应者AR活性降低（Wilcoxon检验，P = 0.06）（补充图4）。作者对经log2转化的TPM表达矩阵在R包VIPER进行VIPER（virtual inference of protein activity by enriched regulon analysis）算法，从基因表达数据推断蛋白质活性来量化AR活性（Regulon是高通量测序后发明的词，即被同一个调控元件调控的一群基因集合），结果表明无反应者的AR活性较低（图5.B）。以上结果表明，是AR活性的降低，而不是AR基因组改变或AR表达改变，造成了恩杂鲁胺的原发耐药性。
补充图4.反应者与无反应者的AR活性评分
图5.A-B 反应者与无反应者差异通路富集分析与AR活性比较
5.细胞干性与谱系特征评估
低AR活性已被证实与细胞干性和谱系可塑性（即通过从AR依赖的腔上皮细胞向 AR不依赖的基底样细胞表型转化），或分化状态的改变有关，被认为是获得性抗AR靶向治疗的常见原因。重要的是，作者研究的所有肿瘤都是腺癌，大多数前列腺腺癌都表达管腔细胞型谱系（Luminal）。然而，基底细胞型（Basal）（具有神经源性/干性特征）存在于部分患者中，并与前列腺癌的侵袭性有关。先前的研究表明，与Luminal谱系的患者相比，Basal谱系局限性前列腺癌对ADT(雄激素阻断治疗/去势治疗)的反应性要低得多。因此，作者接下来在R包GSVA中进行ssGSEA分析了这些谱系signature，无反应者激活了Basal谱系，而在反应者中激活了Luminal谱系（图5.C），与先前前列腺癌中研究Basal谱系的结果一致。
为了确定神经源性基因表达的作用，作者评估了先前用于区分神经内分泌性前列腺癌（NEPC）与腺癌的一组基因（Beltran NEPC基因signature）在无反应者与反应者中的差异表达。在NEPC患者肿瘤中上调的29个基因在无反应者中被激活，NEPC患者肿瘤中许多与AR活性有关的下调的41个基因在无反应者中失活（图5.D）。这些结果进一步表明，无反应者的肿瘤具有干性特征，且AR活性较低。总的来说，该研究揭示低AR活性，干性特征可能有助于恩杂鲁胺的原发抗药性。
图5.C-D Basal/Luminal谱系GSEA分析与神经源性基因差异
小结
本篇文章作者结合自己的临床研究数据，DNA-Seq、RNA-Seq数据，证实了原发(de novo)恩杂鲁胺耐受与其靶点雄激素受体AR的基因差异和表达差异无关，而与AR的蛋白质活性有关。考虑到获得性抗AR靶向治疗与神经源性和干性特征有关，作者还分析了这两个特征在原发抗恩杂鲁胺治疗的作用。在分析过程中，不满足正态分布的功效分析方法以及用VIPER分析从表达数据库推测蛋白质活性都值得大家学习。