HPLC方法开发重要但容易被忽略的一步——合理地选择色谱柱
HPLC分析最大的挑战就是能够在最短的时间内选择出最合适的色谱柱和流动相方法，从而实现分析物的分离。根据调查统计，绝大多数分析人员在开发方法时最常使用以下几个方法：
(1) 参照文献；
(2) 咨询同事或是色谱专家 ；
(3) 选择自己最“认可”的色谱柱进行尝试，如果结果不满意，再尝试手中的其他色谱柱。
参照文献是很直接的一条途径，但是我们需要评估所参照的文献方法是否适合我们的分析样品。因为如果产品制造过程和原制造厂家的方法不同或是初始原料含有不同的杂质，最后的产品就可能产生不同的杂质，而参照的文献方法有可能无法将这些杂质分离出来。此外所参照的文献可能是在当时色谱条件下所能得到的最佳方法，但是因为近年来色谱分析仪器和色谱柱的不断进步，在现阶段更优异的色谱条件下，有可能开发出比参照的文献更快速，分离度更好或是分离出更多杂质的分析方法。
如果没有文献可以参考或是咨询同事和专家也无法得到好的结果，一般色谱分析人员大多凭自己的经验或是喜好选择手中的一支色谱柱（绝大多数是最常用的常规C18柱），进行流动相的调整以期达到分离的效果，如果无法达到分离效果，就换另外一支色谱柱（往往是另一家厂家的 C18柱），再重复进行流动相的调整。这种方式有两大缺点：
(1) 耗时耗力：目前商品化的反相色谱柱的种类已经接近或者超过1000种，其中绝大多数色谱分析最常使用的是常规C18的固定相（60%以上）。不同厂家的常规C18柱都有些差异，但是也不能期望不同的常规C18之间的差异可以大到解决手中的分离问题。因此通过逐一尝试不同品牌的C18来达到分离目的是很耗时耗力的方法开发策略。
(2) 无法确定分析物中是否还有其他的杂质：仅筛选不同的常规C18色谱柱对现阶段要求日趋严格的色谱分析是不够的，如果分析物中含有和主分析物结构非常相近的杂质，它们的疏水性差别很小，就很可能无法凭着主要靠疏水作用保留和分离化合物的常规C18柱分离出来。
如果我们想要在HPLC分析中得到好的分离度，同时尽可能将所有杂质分离出来，那么仅仅使用以疏水作用为主的C18柱已经不能满足色谱分析的需要，所以方法开发初期的正确策略是筛选具有“选择性差异”的固定相。——这是非常重要却往往被大多数色谱分析人员所忽略的一步。
色谱专家John Dolan曾经说过：”在方法开发的初期，筛选选择性差异的色谱柱绝对是最节省时间的投资（...screening several columns of different selectivity is a fruitful investment of time early in the separation development process.）”。那么到底什么是选择性差异的反相色谱柱？为何筛选选择性差异的色谱柱那么重要？
首先我们必须了解影响分离度的三个重要要素：柱效，保留因子和选择性，以下方程式和图表提供三个参数和分离度之间的关系：
图表很清楚的显示各个参数对分离度的影响程度。纵坐标代表分离度（R），横坐标代表保留因子（K），柱效（N）和选择性（α）三个参数。从图表上可以看出，保留因子在10以上对分离度基本没有太大影响；分离度和柱效的平方根成正比，可以看到随着柱效增加对分离度的影响曲线逐渐平缓；而选择性对分离度的影响的曲线却一路走高，在三个参数中有一骑绝尘之势。以下直接通过数字演算来检视哪个参数对分离度影响最大。
首先将初始保留因子设定在理想范围（2-10）的中间值4，柱效设定为10000，选择性设定为1.1 。根据上述方程式所得到的分离度为1.8：
(1) 如果将保留因子增加一倍（由4增加到8），其他两个参数不变：
(2) 如果将柱效增加一倍（由10000增加到20000），其他两个参数不变：
(3) 如果将选择性增加约10%（由1.1增加到1.2），其他两个参数不变：
由上面的数据比较，可以得到以下结论：
(1) 保留因子增加一倍（由4增加到8 ），分离度增加约10%，
(2) 柱效增加一倍（由10000 增加到20000），分离度增加约44%，
(3) 选择性增加约10%（由1.1增加到1.2 ），分离度增加了83%。
三者比较之下，很明显的看出改变选择性对分离度的影响最大。
而改变选择性其实就是改变分析物、固定相以及流动相三者之间的作用，因此改变选择性的方法虽然有很多，但是可以分成两大类：
(1) 改变固定相：使用不同键合相或是硅胶颗粒；
(2) 改变流动相：使用不同的溶剂、pH、缓冲液种类和浓度、柱温、变动梯度大小。
而其中固定相对分离度的影响最大。也就是说为了解决峰重叠的问题或是尽可能检测出分析物中所有的杂质，最有效的手段就是在方法开发初期筛选不同固定相的色谱柱（选择性差异的固定相）。如果一开始选出最合适的色谱柱，可以节省后续的流动相或是其他方法优化的时间。
我们在初始选用一种色谱柱分析后，需要再选用其正交柱（Orthogonal）进行分析，以比较两者的分离的效果。原来选用的色谱柱和其正交柱除了表现出不同的分离效果，甚至还可能出现两者出峰顺序会有很大的不同的现象。对一些原来无法分离的化合物或是没有被检测出来的杂质，经由正交柱分析很可能可以分离或检测出来，可以进一步确认哪一种固定相比较适合。一旦满意的色谱柱确定以后，下一步就是改变流动相或是其他的条件（例如颗粒大小，柱长短）以进一步优化分离效果。
既然筛选色谱柱是开发方法重要的第一步，首先必须了解分析物和固定相之间有哪些不同的作用力。不同的固定相因为具有不同程度的各种作用力，因而可以对分析物产生不同的选择性。
(1) 疏水相互作用：在反相色谱法中，使溶质保留的主要作用是疏水作用，所谓疏水作用即当水中存在非极性溶质时，溶质分子与水分子之间的相互作用远小于水分子之间的相互作用，因此溶质分子从水中被“挤”了出去。当溶质分子被流动相推出，而与固定相接触时，溶质分子的非极性部分就会与非极性固定相上的烷基官能团相互吸引（相似相溶）。在反相色谱分析中，疏水性越强的化合物越容易从流动相中挤出去，而与固定相的非极性基团相作用，因此在反相色谱柱中保留时间相对也比较长，所以不同的化合物根据它们的疏水性的强弱得到分离。反相的烷基色谱柱（C18，C8，C4等等）适于分离带有不同疏水基团的化合物，即非极性基团的化合物。
(2) 形状选择性：固定相依据分析物不同的形状而产生不同的选择性。一般长的烷基链拥有较高的弹性及较低的形状选择性 （b左图），而短且庞大的链较僵硬而有较高的形状选择性。例如固定相利用烷基和苯基键合（b右图），可以得到比烷基长链有较刚性的平面结构基团，而得到较好的立体互动的形状选择性。比较两种固定相可以发现带有苯基的固定相对位置异构体有更好的分离效果。
(3) 氢键作用（固定相氢键给予能力或氢键接受能力）：对于酸和碱这两类氢键给体和供体来说，氢键作用是一种非常重要的在色谱分析中可以利用的作用力。除了常规烷基柱的硅胶表面的游离硅醇基提供这种氢键作用的机会外，新的固定相设计已经能够提供兼具氢键作用和一般烷基疏水作用的反相固定相。
(4) 离子相互作用（或称为硅醇基的交互作用）：这种作用多年来一直不受欢迎，因为这是造成碱性化合物拖尾的主要原因。许多色谱柱制造商通过竭尽所能地利用不同端基封尾技术及使用超高纯度的硅胶，这种交互作用已经可以降低到非常低的程度了。在硅胶表面的带电硅醇基可与带电碱性物质产生离子交换作用，而得到另一类有效的分离作用方式。新的固定相设计也可以提供兼据离子交换和一般烷基疏水作用的反相固定相。
(5) 偶极-偶极作用：极性分子间普遍的一种相互作用，即一个极性分子带有部分正电荷的一端与另一分子带有部分负电荷的一端之间的吸引作用。当带有极性基团的固定相就有可能和极性的分析物产生这种作用。
(6) π-π作用：苯基柱或是氰基柱提供了和带有苯基或者其他π键的分析物相互吸引作用，这作用通常存在于相对富电子和缺电子的两个分子之间，是一种与氢键同样重要的非共价键相互作用。
(7) 螯合作用：在色谱柱硅胶基质的制造过程中，很可能带入金属离子，当分析物带有一个或多个多齿配体提供多对电子，就容易与金属中心体形成配位键。所以硅胶中金属含量的多少，就会影响到多对电子化合物的保留时间。利用这金属螯合作用，或许可以分离不同程度的多对电子化合物，但是如果硅胶金属含量过多，对多对电子化合物则会有严重拖尾现象和过长的保留时间，甚至可能将其保留在柱内而不出峰。
Dolan和Snyder根据分析物和固定相之间的疏水作用（H）、形状选择性（S*）、氢键给与能力（A）、氢键接受能力（B）和阳离子交换（C）5个不同参数提出反相色谱柱选择性的疏水性差模型。而利用色谱柱选择性比较函数Fs，可以比较色谱柱之间的选择性差异:
Dolan和Snyder曾经对一些色谱柱进行测试，根据Fs的差异而分类出不同的选择性的色谱柱，这对色谱分析的研究者来说，这是一个划时代的突破，极大地方便我们更加科学、精确地选择色谱柱。
但是由于每个实验室中都有不同厂家的色谱柱，同时不断有新的色谱柱被设计和制造出来，如果对每支色谱柱的结构或是其作用力的种类了解不深的话，利用以上的选择性的差异模型来区分手中色谱柱的选择性差异就不很实际。
一个最简单直接的方法就是筛选3-6支选择性差异的色谱柱。以下几类色谱柱有着不同的作用力，也就提供不同的选择性，建议每个实验室可以考虑拥有(1)常规C18，(2)苯基类（或是带有苯基的C18或其他长链烷基柱），(3)酰胺类（或是带有酰胺的C18或其他长链烷基柱），(4)氰基类（或是带有氰基的C18或其他长链烷基柱）。
(1) 常规C18柱：这是实验室使用最普遍的反相色谱柱，任何分析人员必须了解所使用的C18柱的键合密度，表面积，是否封端和如何封端，这些都会影响到C18柱的疏水作用的能力以及次级极性作用的能力。可以选用以上参数差异较大的不同常规C18柱进行筛选。
(2) 苯基类：苯基柱提供了和带有苯基的分析物相互吸引作用，而这作用通常存在于富电子苯环和缺电子苯环之间。所以选择固定相为富电子苯环（苯基）和缺电子苯环（五氟苯基）两大类型的色谱柱，可以涵盖缺电子和富电子苯环的分析物。大多的苯基柱是短链烷基的苯基柱，这类色谱柱有两个缺点：（1）容易柱流失，（2）苯基提供疏水作用以外的另类重要苯基极性作用，但是失去了C18的强疏水作用。为了能够享有C18的疏水作用和苯基的极性作用，可以考虑选用带有C18的苯基柱，可以获得强的疏水和苯基双重的作用优势，同时可以大大减少柱流失。
(3) 酰胺类：酰胺的结构同时具有氢键作用和羟基的偶极作用。而氢键作用既有氨基的氢键给与能力，也有羟基的氢键接受能力，对任何化合物具有氢键作用差异有特别的分离效果。
(4) 氰基柱：兼具偶极-偶极和Pi-Pi作用，提供和C18疏水作用互补的一款色谱柱.和短链苯基柱有相同的缺失，也就是容易柱流失。可以选用较长烷基链的氰基柱，除了减少柱流失，也可保有长烷基链的强疏水作用。氰基柱可以在正相或是反相模式下使用。
综合以上的介绍，对色谱分析实验室建议备有以下3-6种的色谱分析柱的配套：
(1) 常规C18柱
(2) 缺电子苯环柱
(3) 富电子苯环柱
(4) 和上述第一类C18柱差异较大C18柱（键合密度，表面积，封端的差异等）
(5) 酰胺柱
(6) 氰基柱
具备这些选择性差异的色谱柱，可以涵盖宽广的分析范围，而减少分析死角。
(1) 色谱分析人员可以根据自己对分析物结构的了解（例如疏水差异，形状差异，氢键差异，π-π差异等），选择上述6种种比较合适的几种色谱柱进行筛选；
(2) 对分析的产品和杂质的特质不很清楚或是分析物很复杂，而无法进行判断时，可以首先尝试前三种色谱柱（1-3）进行筛选，如果分离效果还是不满意，就进一步筛选后3种色谱柱（4-6）。
综上，筛选固定相绝对是方法开发的首要步骤，然后调整流动相（溶剂，缓冲液浓度，柱温，梯度，或是pH）或是改变柱效（颗粒大小，柱长短）进一步优化方法，从而高效地完成HPLC的方法开发。
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参考文献
(1) J.H.Zhao,P.W.Carr, An Approach to the Concept of Resolution Optimization through Changes in the Effective Chromatographic Selectivity, Anal. Chem. 1999, 71, 2623-2632.
(2) J.W.Dolan,Selectivity in Reversed-Phase LC Separations, Part III: Column-Type Selectivity. LCGC North America, 2011, 29, 236-244.
(3) T.Taylor, Getting The Most from Phenyl Stationary Phases for HPLC, LCGC North America 2016.
(4) J.W.Dolan,L.R.Snyder, The Hydrophobic-Subtraction Model for Reversed-Phase Liquid Chromatography: A Reprise, LCGC North America, 2016, 34, 730-741.
(5) J.W.Dolan,D.R.Stoll,L.R.Snyder, How To Take Maximum Advantage of Column-Type Selectivity. LCGC North America, 2017, 35, 660-667.