【基础】流式胞内细胞因子检测 I
I.导言
单细胞胞内细胞因子分析方法在持续不断改进中，分析技术包括ELISPOT，原位杂交(in situ hybridization)，免疫组织化学(immunohistochemistry)，有限稀释分析和单细胞PCR等。相比较流式细胞术是一种强大的分析技术，可以同时分析单个细胞的多个参数，包括大小和粒度，以及由荧光抗体表征的表面和细胞内标记物的表达。
胞内细胞因子和趋化因子对应的荧光标记单克隆抗体应用已经非常成熟，也适用于混合细胞群内胞内染色和多色分析。表面和胞内相结合的多色免疫荧光染色提供了一种高分辨率方法，用于鉴定表达特定细胞因子的细胞的性质和频率。已经有非常多的应用案例如细胞因子表达受限制的（如，Th4与Th2样）或不受限制的（如，Th0）各种细胞类型的分析。除了能够同时对单个细胞进行高特异性和高灵敏的多个参数同时测量外，该方法还能够快速收集大量细胞信息，进行统计学意义上的分析。
胞内细胞因子的染色取决于细胞因子特异性单克隆抗体的鉴定，及其与固定-透化过程的相容性。已经报道了使用多聚甲醛固定和用去污剂皂苷对细胞膜透化的组合的最佳细胞内细胞因子染色。多聚甲醛固定允许保持细胞形态和细胞内抗原性，同时还使细胞能够承受去污剂的透化作用。皂苷的膜透化使细胞因子特异性单克隆抗体穿透内质网和高尔基体的细胞膜，胞质溶胶和膜。
细胞因子染色的关键参数包括：细胞类型和激活方案-活化后细胞收获的时间-细胞活化过程中包含蛋白质转运抑制剂-和抗细胞因子抗体的选择等。
II.一般方法
A.刺激细胞
已经报道了各种用于刺激细胞产生细胞因子的体外方法。多克隆活化剂包括有：佛波酯和钙离子载体；植物血凝素;葡萄球菌肠毒素B；和针对TCR/CD3复合物亚基的单克隆抗体（有或没有针对共刺激受体如CD28的抗体）。
注意：据报道，单独使用PMA进行细胞活化会导致小鼠T细胞表面CD4表达的瞬时丧失；用PMA和钙离子载体一起活化细胞会引起CD4表达的更大和更持久的降低，以及小鼠胸腺细胞、小鼠和人外周T淋巴细胞中CD8表达的降低。
建议在体外细胞活化期间使用细胞内蛋白质转运抑制剂进行细胞因子阻滞。使用GolgiStop™ (含有 monensin) 或 GolgiPlug™ (含有 brefeldin A)阻断细胞内转运过程并导致大多数细胞因子蛋白在粗面内质网或高尔基复合体中积累。这使得流式更易于检测细胞因子产生的细胞。由于这些试剂具有剂量和时间依赖的细胞毒性作用，因此必须限制共培养的时间。
注意：研究人员应了解转运抑制剂对细胞表面标志物表达水平的可能影响。已发现Brefeldin A会导致CD14染色水平降低。
刺激、活化人细胞产生细胞因子的培养物
1. 人细胞IL-3 +，IL-4 +，IL-5 +，IL-13 +和GM-CSF +（特别是IL-5 +和IL-13+）的分泌：人PBMC，纯化的人CD4 +或CD8 +细胞，用固定化的抗人CD3抗体(clone UCHT1, 10 µg/ml 包被孔板)，可溶性抗人CD28抗体(clone CD28.2, 2 µg/ml)，重组人IL-2(10 ng/ml)和重组人IL-4(20 ng/ml)，共培养2天。洗涤细胞，随后在含有rhIL-2和rhIL-4的培养基中再培养3天。最后，收获细胞并用PMA(5 ng/ml; Sigma, cat. no. P-8139)，钙离子载体(calcium ionophore A23187 250 ng/ml; Sigma, cat. no. C-9275)或离子霉素(ionomycin 500 ng/ml; Sigma, cat. no. I-0634)，在蛋白质转运抑制剂(GolgiStop或 GolgiPlug)存在下，再刺激4小时。
2. 人细胞TNF-α+的分泌：用固定化的抗人CD3抗体(clone UCHT1, 10 µg/ml 包被孔板)和重组人IL-2(10 ng/ml) ，共培养2天。洗涤细胞，随后在含有rhIL-2的培养基中再培养3天。最后，收获细胞并用PMA(5 ng/ml; Sigma, cat. no. P-8139)，钙离子载体(calcium ionophore A23187 250 ng/ml; Sigma, cat. no. C-9275) 或离子霉素(ionomycin 500 ng/ml; Sigma, cat. no. I-0634)，或者可以用抗CD3和抗CD28抗体，在蛋白质转运抑制剂(GolgiStop或 GolgiPlug)存在下，再刺激4小时。
3. 人细胞IL-2 +，TNF-α+和IFN-γ+ +的分泌：用PMA(5 ng/ml)，钙离子载体(calcium ionophore A23187 500 ng/ml)或离子霉素(ionomycin 500 ng/ml)，在蛋白质转运抑制剂(GolgiStop或 GolgiPlug)存在下，刺激人PBMC 6小时。
4. 人细胞IL-1α+，IL-6 +，IL-8 +和GRO-α+的分泌：用LPS (1.0 µg/ml; Sigma cat. no. L-8274)，在蛋白质转运抑制剂(GolgiStop或 GolgiPlug)存在下，刺激人PBMC 4小时。
5. 人细胞IL-10 +，MCP-1 +，MIP-1α+，MCP-3 +和MIG +的分泌：用LPS (1.0 µg/ml)，在蛋白质转运抑制剂(GolgiStop或 GolgiPlug)存在下，刺激人PBMC 24小时。
6. 人细胞IL-12 +的分泌：人PBMC用rhIFN- γ (10 ng/ml) 刺激2小时，然后在蛋白质转运抑制剂(GolgiStop或 GolgiPlug)存在下，用IFN- γ (10 ng/ml) 和 LPS (1.0 µg/ml)再活化22小时。
7. 人细胞RANTES +的分泌：因为T细胞可以组成性地表达RANTES（其表达通过刺激会上调），人PBMC可以在蛋白质转运抑制剂(优选GolgiStop)的存在下简单地培养24小时而自然累积该因子。
刺激、活化小鼠细胞产生细胞因子的培养物
1.IL-2 +，TNF-α+和IFN-γ+小鼠细胞：在蛋白质转运抑制剂(GolgiStop或 GolgiPlug)存在下，用PMA (5 ng/ml)和离子霉素ionomycin (500 ng/ml)刺激小鼠脾细胞4小时。
2.IL-3 +，IL-4 +，IL-5 +，IL-10 +，GM-CSF +小鼠细胞：来自6个月大的BALB / c小鼠的纯化的CD4 +脾细胞用孔板包被的抗小鼠CD3抗体 (clone 145-2C11, 25 µg/ml)、可溶性抗小鼠CD28抗体 (clone 37.51, 2 µg/ml)，rmIL-2 (10 ng/ml) 和 rmIL-4 (50 ng/ml)一起共培养2天，然后仅用rmIL-2和rmIL-4再孵育3天。最后在蛋白质转运抑制剂存在下，用孔板包被的抗小鼠CD3抗体 (25 µg/ml) 和可溶性抗小鼠CD28抗体 (2 µg/ml) 再刺激4小时。或者，在蛋白质转运抑制剂(GolgiStop或 GolgiPlug)存在下，用PMA (5 ng/ml)和离子霉素ionomycin (500 ng/ml)再刺激。
3.IL-6 +，IL-12 +，TNF-α+小鼠细胞：收获3天巯基乙酸盐诱发的腹膜细胞，并用1μg/ ml LPS和GolgiPlugTM刺激4小时。
4. MCP-1 +小鼠细胞：来自6个月大的BALB / c小鼠的巯基乙酸盐诱发的腹膜巨噬细胞，在蛋白质转运抑制剂(GolgiStop或 GolgiPlug)存在下，用LPS (1 µg/ml)过夜刺激。
刺激、活化大鼠细胞产生细胞因子的培养物
1.IL-4 +和IL-10 +大鼠细胞：来自成年大鼠的纯化的脾CD4 +细胞用平板结合的抗大鼠CD3(clone G4.18, 25 µg/ml)，可溶性抗大鼠CD28 (clone JJ319, 2 µg/ml)，重组大鼠IL-2 (10 ng/ml) 和 rrIL-4 (50 ng/ml)一起培养2天，然后仅用rrIL-2和rrIL-4孵育3天。在蛋白质转运抑制剂存在下，再用PMA (5 ng/ml)和离子霉素ionomycin (500 ng/ml)刺激4-6小时。或者，可以在蛋白质转运抑制剂(GolgiStop或 GolgiPlug)存在下，用平板结合的抗大鼠CD3和可溶性抗大鼠CD28再刺激4-6小时。
未完待续......
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